结核分枝杆菌传统药敏试验方法.ppt

1、传统的药敏实验 S J Kim, The Union,药敏试验的目的,耐药监测 - 评估治疗方案 - 选择有效的标准方案 病例管理 - 诊断耐药结核病(耐多药/广泛耐药结核病） - 为个体病例(耐多药/广泛耐药结核病）选择有效的方案,问题 可靠性: 技术重复性/ 临床反应预 测 周转时间 操作可行性及可持续性 成本,基于标本的药敏检测系统 直接法 直接涂片法（涂片阳性） 优点: 结果快; 更好的反映耐药情况 缺点: 大多数药敏试验不理想;接种量不容易标化/ 可行性较差 -间接法 对结核分枝杆菌进行培养后进行药敏试验 优点: 更好的控制接种量 缺点: 结果延迟,以传统的生长检测为基础的药敏试验方

2、法 以传统生长检测为基础的方法 WHO（1963）的标准方法 绝对浓度法- Meissner - 标化接种量; 药物浓度梯度 抗性比率法- Mitchison - 克服培养基中药物浓度变化的缺点 比例法- Canetti / Grosset - 临界浓度比例,更好的控制接种量 G Canetti/ J Grosset, France; S Froman, USA; P Hauduroy, Switzerland; M Langerova/ L Sula, Czechoslovakia; HT Mahler (WHO); G Meissner, Germany; DA Mitchison, En

3、gland,以快速培养生长检测为基础的药敏试验方法 快培生长系统 观察显微镜下的微小菌落: - 玻片培养；显微镜观察的药敏试验（MODS） 代谢情况检测: - CO2 产生量(放射BACTEC 460; 色素变化 MB/Bact 3D) - O2 消耗 (荧光产生 MGIT960) - TREK系统 (ESP 培养系列 II) - 微盘： 阿莫拉蓝试验 (指示管)/TEMA - ATP 产生, 生物荧光试验 噬菌体检测: FASTPlaque; Bonx box (LRP),以检测基因突变为基础的快速药敏试验系统 扩增目标区的DNA测序 聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术; - 探针杂交：反

4、向探针线性杂交方法； Hain 分枝杆菌药物抗性plus 分子灯塔/信标： GeneXpert系统是一个将样品准备、定量扩增和荧光检集于一身并自动进行核酸检测分析的系统; LAMP (Eiken) 核酸环介导等温扩增技术 高效液相色谱应用与扩增的DNA 的突变检测,药敏试验的结果可靠性 治疗结果的预测值- 药敏试验的耐药标准 试验可靠性 - 试验精确度 PR = 50 菌株,Cantti G, et al. Bull WHO 1969; 41:21-43.,可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药物浓度下的抑菌分布,Minimal inhibitory concentrations (MIC

5、) 最小抑菌浓度,Frequency of strains,Clinically susceptible strains (PS),Break point,1 SD,3 SD,不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,Frequency of strains,Minimal inhibitory concentrations (MIC),Break point,*Technical variation (inoculum/ media/ drug concent.),Clinically susceptible strains (PS),Clinically resistan

6、t strains (PR),不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,Frequency of strains,Minimal inhibitory concentrations (MIC),PS,PR,2 mcg/ml,Break point,13.1 as “R”,75.8,11.1 as “S”,可能敏感/可能耐药菌株对利福平的最小抑菌浓度的累积分布（此试验采用 L-J 培养基用绝对浓度法）,85.8,不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,Frequency of strains,Minimal inhibitory concentrations

7、 (MIC),Break point,*Inoculum variation,Clinically susceptible strains (PS),Clinically resistant strains (PR),可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星敏感性分析,采用 L-J 培养基,Do not quote this data!,(n=81) (n=111),校正的乙胺丁醇的临界浓度(此试验采用改良罗氏培养基的绝对浓度法),42%,50%,可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对卡那霉素敏感性分析,In L-J Medium,In 7H10 Medium,67%,67%

8、,抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值,EMB,ETH,OFX,CFX,INH,RMP,KM,CPM,PAS,SM,*Proportion,WHO推荐药敏试验的临界浓度, 2007,抗结核药物药敏试验 程序复杂：必须在有质量保证的实验室才能实施 2.试验操作危险大：操作只能在拥有好的设施及设备的实验室(BSL-3)进行，而且所有的实验室工作人员都要熟练的掌握每个程序,影响药敏试验结果的物理化学环境因素 培养基中活动性/精确的药物浓度 药粉.试剂 效价：剂量/溶解/稀释/存储 purity x active fraction x H2O EMB: 99% purity; C10H24N2O2.2H

9、Cl (277.2-72.9=204.3); no water; 0.99 x 0.74 x 1.0 = 0.7326; 1000 mg733 mg -培养物的制备： ( 1)灭菌过程中热失活(2)蛋白结合； (3)拮抗剂/离子(4) pH值 接种量: - 接种量/ 离散度/ 可代表性 - 组织物的可行性试验,浓缩过程中利福平的稳定性,抗结核药物的储存 在密封的硅胶容器内储存 (最好在真空下储存),药敏试验接种物的制备,Inoculate 0.1 ml volume of inoculum onto each medium,比例法 (by Middlebrook & Cohn),Dilute稀

10、释 1mg/ml bacterialsuspension to 10-3 & 10-5 mg/ml by serial 10 fold dilution. Plant 接种 0.1 ml onto each slope of drug-free or containing medium 制备培养基 Observe 观察 the growth after 4 weeks incubation (if the growth is poor, again after 6 weeks). 观察4周生长情况（如果培养基质量较差应观察6周） Report 报告the proportion of colon

11、ies grown at the critical concentration of the drug. 在药物的临界浓度报告结果,Drug free Isoniazid Ethambutol Inoculum media 0.2 mcg/ml 2.0 mcg/ml 10-3 + + 3 10-5 26 9 0 % resistant 34.6 0.1 Interpretation Resistant Susceptible,药敏试验结果-1,1 . If use nichrome wire (0.7 mm wire/ 3 mm of internal diameter), inoculate

12、 oneloopful of bacterial suspension of 10-2 / or if use pipette, inoculate 0.1 ml of 10-3 / of bacterial suspension 2. If use nichrome wire, inoculate one loopful of 10-4 / bacterial suspension or if use pipette, inoculate 0.1 ml of 10-5 /.,药敏试验结果-2,1 . If use nichrome wire (0.7 mm wire/ 3 mm of int

13、ernal diameter), inoculate oneloopful of bacterial suspension of 10-2 / or if use pipette, inoculate 0.1 ml of 10-3 / of bacterial suspension 2. If use nichrome wire, inoculate one loopful of 10-4 / bacterial suspension or if use pipette, inoculate 0.1 ml of 10-5 /.,药敏试验结果-3,1 . If use nichrome wire

14、 (0.7 mm wire/ 3 mm of internal diameter), inoculate oneloopful of bacterial suspension of 10-2 / or if use pipette, inoculate 0.1 ml of 10-3 / of bacterial suspension 2. If use nichrome wire, inoculate one loopful of 10-4 / bacterial suspension or if use pipette, inoculate 0.1 ml of 10-5 /.,药敏试验的技术

15、可靠性,外部质量评估,17个跨国参比实验室网络第14轮熟练度测试结果（数据来源于Armand Van Deun 2007年）,蓝色数字表示实验室数量,51个国家（或地区）参比实验室利福平和异烟肼药敏试验结果的一致性（世界卫生组织第四期全球耐药报告，2008）,二线抗结核药物耐药预测值,1 Prevalence rates 2 Results of SLDST proficiency tests done once in 2004 (coordinated by Dr. Nuria Martine Casabona) (participated SRL=9) 3 Based on sensitivity/ specificity of 9 rounds proficiency tests of SRLs, 1994-2002,利福平敏感性试验耐药预测值基于跨国参比实验室网络第14轮熟练度测试数据（来源于Armand Van Deun）,Resistance predictive values (%),Resistance prevalence