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1、第五章 结构基因,比德尔和塔特姆（1941）通过对粗糙脉孢菌营养缺陷型突变性状分析提出“一个基因一种酶”假说.阐明了结构基因的功能和作用。 第 一 节 一个基因一种酶假说 一 营养缺陷型 1、营养缺陷与遗传代谢性障碍,1）营养缺陷型和基因突变,2）遗传代谢性障碍,分离足够多的营养缺陷型菌株，常常发现引起相同突变的基因并不是等位的。 那么几个非等位基因突变产生同一营养缺陷型的现象如何解释?,等位基因:是指在一对同源染色体上，占有相同座位的一对基因 (显性基因和隐性基因)，它控制一对相对性状(显性性状和隐性性状)。,以需要某一种氨基酸D的营养缺陷型为例，设想D在细胞中是通过xABCD的一系列反应才

2、合成的。 不能进行其中任何一种反应的缺陷型都是D缺陷型。,甲、乙 、丙和丁为四种氨基酸D营养缺陷突变型： 甲 乙 丙 丁 xABCD,由此可以推测需要同一种氨基酸D的缺陷型是功能上不相同的一系列基因突变的结果。,+,甲 乙 丙 丁 xABCD,引起相同突变的基因可以有多个。,2、互养,1）微生物通过培养基互相提供养料而生长的现象称为互养。 2）上述不同氨基酸D缺陷型还可以通过互养实验来区别。 将不同的突变型接种到足以使突变型进行少量生长的氨基酸D培养基上。,甲 乙 丙 丁 xABCD,突变型丁：CD不能进行，其后果：一方面需要D，另一方面C积累分泌到培养基中，有益于突变型甲、乙和丙的生长。 突

3、变型丙：使突变型乙或甲生长，但不能使突变型丁生长，可是丁能促进丙和乙生长 突变型丁和丙：分别促进乙的生长。,通过对营养缺陷型研究，得出以下结论： 遗传性代谢障碍是由于基因突变的结果。 每一个基因突变造成一个特定的障碍，使一个特定的生化反应不能进行。,二 一个基因一种酶假说的初步验证,（一）交叉反应物质 “一个基因一种酶”假说指出：每一个基因控制一种酶的一级结构，基因突变使酶的一级结构改变，从而使酶的活性丧失。,这一假说验证的关键是证明在突变株中有失活酶的存在。 主要实验方法有：免疫血清反应 免疫血清反应:一种酶的免疫血清能和该酶蛋白发生沉淀反应使之失去酶活性。,在缺陷型突变株中某一种酶的活性消

4、失了，可是一级结构略有改变的这种酶蛋白，也会与该酶的免疫血清反应而测得它的存在。 这种失去酶活性但仍保存了免疫血清学特性的物质称为交叉反应物质（CRM）。,（二）温度敏感突变型,用测定交叉反应物质的方法说明突变所影响的是酶蛋白质的结构而不是影响酶的合成功能。 另外还有一些突变，它们并不使某一种酶的活性完全消失，而是使它改变某些性能。 在粗糙脉孢菌中有一个腺嘌呤核苷酸缺陷型F15，它在25中生长时不需要腺核苷，但是在35中生长时则需要腺核苷作为补充养料。 这是由于突变型的腺苷酸琥珀酸酶和野生型的酶在高温中活性不同所致。 在粗糙脉孢菌中还有一个影响色氨酸合成酶 的突变型td24，它在25中生长时需

5、要色氨酸作为补充养料，但是在30中生长时则并不绝对需要色氨酸。 这种突变型的色氨酸合成酶的作用能为细胞中的锌离子所抑制。将突变型的酶除去金属离子以后便恢复了它的活性。,证明失活酶存在的实验过程：,试管滴定法：,用野生型菌株的酶注射家兔，取得它的抗酶抗血清,在突变株酶抽提物中加入抗血清,反应后离心去除沉淀物,在上清液中加入野生型代谢酶,若不产生或只有很少沉淀产生，说明突变株中有与酶蛋白结构相似的CRM。,培养皿测定法：,野生酶,抗酶抗血清,2,3,4,5,6突变型抽提物,如果突变株抽提物中有CRM存在，也会产生相同的沉淀带.,抗血清将在琼脂中扩散,在抗血清和酶接触的地方形成肉眼可见的白色沉淀带,

6、第二节顺反子和互补群,基因一般通过三个方面的遗传学现象来认识。 -由于发现某一个突变型，而推测有某一个野生型基因的存在； -由于发现连锁基因之间的交换，而使我们认识基因在染色体上的排列； -由于突变型的某些生理功能不同于野生型，使我们认识各个基因具有不同的生理功能。 经典遗传学：认为基因是一个突变的单位，也是重组的单位，也是功能的单位。 本节通过顺反位置效应测验讨论究竟什么是基因？,一 互补测验和顺反子概念,每一个基因在染色体上都占有一个特定的位置，这一位置只能为这一基因的各个等位基因所占有，但是不能为另一基因座的基因所占有。 所以可以不考虑两个基因的功能有什么不同，只要证明它们占有不同的位置

7、，一般就能知道它们是两个基因。 而每一个基因都有它特有的生理功能，所以不用知道它们在染色体上的位置，只要证明它们是否具有不同的生理功能，就能说明它们是否等位的。,1 互补测验,-怎样判断两个突变型所丧失的功能是否相同呢? 互养：涉及几个属于同一代谢途径的突变型，所以一个突变型所积累的物质可以使另一个突变型得以生长。如果两个营养缺陷型属于不同的代谢途径，那么它们可以互相供给彼此所不能合成的物质而使两者都能生长。 例如，把一个氨基酸缺陷型和一个核苷酸缺陷型接种在同一含有微量所需物质的基本培养基的邻近位置上，两者都能正常地生长，因为前者供给后者以核苷酸，而后者供给前者以氨基酸。 互养通过共同的培养基

8、而进行。两个能表现互养现象的突变型可以认为它们属于两个基因。 互补作用：是使二个突变型的染色体同处于一个细胞内，在不发生基因重组的条件下，由于相应突变型基因的相互补偿而使细胞表型正常化的作用。 互补作用在实质上是两个突变基因在同一细胞内的互养作用。,互补测验的基本要求： 不发生基因重组。 凡是符合这一要求的二倍体、半合子，异核体，或者是感染了两个突变型噬菌体的寄主细菌都可以用作互补作用的测验系统。,1）异核体形成测验,将两个营养缺陷或其它突变型的分生孢子混合接种在基本培养基上，若能培养（基本培养基)获得异核体菌株），则表明供试突变型的两个基因在功能上不相同，属非等位基因。,反之，如果不能形成异

9、核体菌株，原因有两个： 供试突变型的两个基因属于等位基因，不能够互补。 还可能来自于两个突变株之间的不亲和性，即两个菌丝体之间不能经质配而形成异核体。,例：已知某一真菌的精氨酸突变株A1-和A2-不能在基本培养基上形成异核体 经过诱变从A1-中筛选获得抗链霉素突变株Smr A1-，从A2-中筛选获得抗卡那霉素突变株Kmr A2- kmr 和smr 为非等位基因。 （该例子同书p206,有两个氨基酸D缺陷型D1和D2， 使它们各带两个非等位缺陷型基因X和Y ）,异核体形成测验和互养测验都是基因互补性测验。,其差异主要在于：互养测验时两个突变株之间通过培养基相互提供自身不能合成的代谢产物（分泌到细

10、胞外）， 异核体形成测验中两个突变基因在同一细胞内相互提供基因转录翻译的产物或酶。,2）顺反位置效应测验,比较结构基因的顺式和反式结构表型效应的互补测验称为顺反位置效应测验。 基因位点：同一个基因的各个突变型结构发生变化的位置。,一个基因座位内可以有多个位点，在发挥作用上仍属于统一的整体，一个座位是一个功能单位，称它为顺反子（cistron）。 当一个座位中的两个突变位点排列在一条染色体上，而两个野生型位点排列在另一条同源染色体上相对位置上时，这种排列称为顺式（cis）, 当一个座位中的两个突变位点分别排列在同源两条染色体上时，这种排列称为反式（trans）(图),顺式,反式,用大肠杆菌噬菌体

11、T4的快速溶菌突变株（r）分别感染B、S和K等三个不同的大肠杆菌菌株，可以进一步区分出rI、rII和r等三种类型,顺反位置效应测验,各种快速溶菌突变型在寄主大肠杆菌B上呈现相同的表现；但是通过另外两个大肠杆菌品系S和K，可以进一步把它们区分为三种类型， r能在B、S、K这三个菌株上形成r型噬菌斑。 r在B上形成r型噬菌斑，在S上形成野生型噬菌斑，而在K上则不形成噬菌斑，因为在寄主细胞K中r突变型噬菌体不能复制。 r在B上形成r型噬菌斑，在S和K上都形成野生型噬菌斑,B：一个大肠杆菌B细胞；K：涂满大肠杆菌K的一个培养皿，每一黑点代表一个噬菌斑 (a)群7对寄主细菌B的单独感染；(b)r47和r

12、104对寄主B的混合感染；(c)r47和r106对寄主B的混合感染； (d)r47和r102对寄主B的混合感染。裂解液分别在含有大量寄主细菌K的培养皿上作重组测定,各种r突变型组合得到的野生型噬菌体数各不相同。 这说明这些突变位点之间的距离不同。,重组实验,通过重组实验可以确定不同缺陷型基因相对位置,重组类型rA+/rB+为野生型, 可在K上形成噬菌斑， 重组类型rA-/rB-为缺陷型,不能可在K上形成噬菌斑。,将一系列r1、r2、r3、r4两两配对，计算两位点重组频率, 确定相对位置. 把所有的r突变型两两互补测验，得到A和B两大群,r47，r106和r51等表型效应相同的位点是属于同一个基

13、因，还是不同的基因？可以通过互补实验证明。,互补实验确定不同突变位点 是否属于同一个基因,互补实验,由此可见，在两个r突变型混合感染时出现的突变型噬菌斑，是由于两个r突变型具有互补作用； 它们相互满足在寄主K中进行复制所需要的因素，从而恢复了复制能力； 在复制过程中发生了基因重组,并产生野生型噬菌体。,互补实验确定不同突变位点 是否属于同一个基因,1 杂基因子测验：大肠杆菌菌的入噬菌体的高频转导中，经常出现不稳定的转导子。 如细胞中某一野生型基因和突变型基因共存, 即个别基因呈杂合状态的细胞称为杂基因子。 例;利用噬菌体的dg和db转导子感染相应的缺陷型宿主细胞，很容易获得杂基因子。,二 测验

14、系统,将Gal-1、 Gal-2、和Gal-4等三个半乳糖发酵缺陷型突变株作为受体菌先划线接种在半乳糖培养基上。 分别滴加从Gal+、Gal - 1、 Gal - 2和Gal - 4获得的高频转导噬菌体dg。,经培养后可以发现：如果供体菌和受体菌突变基因不同，那么均可出现红色的转导子。 在Gal-1和Gal-4之间只产生少量延迟出现的红色小菌落,伊红美兰琼脂培养基（EMB） 该培养基中添加半乳糖为碳源,如果大肠杆菌为半乳糖发酵缺陷型,则不能生长,如果能够发酵利用半乳糖,产酸产气, pH变化引起伊红美兰颜色变化,形成红色大菌落.,Gal-1、 Gal-2、和Gal-4为半乳糖发酵缺陷型突变株,整

15、片红色菌落是杂基因子后互补的结果；,延迟出现的少数红色菌落发生基因重组的结果。,首先出现的整片红色菌落是供、受体菌基因形成杂基因子后互补的结果； 延迟出现的少数红色菌落是由于杂基因子在繁殖过程中发生基因重组的结果。,根据以上实验结果，可以确定Gal-1、 Gal-2和Gal-2、Gal-4属于不同的顺反子-互补作用 Gal-1和Gal-4属于同一顺反子-重组作用。,2 流产转导测验,在鼠伤寒沙门氏菌P22转导系统中，可以看到有一种正常的菌落和一种微小的菌落。 前者是完全转导的结果，后者是流产转导的结果。完全转导子是通过供体和受体染色体的交换而形成的野生型重组子。而在流产转导子中供体染色体片段并

16、没有和受体染色体发生交换 所以在沙门氏菌P22转导实验中如果只出现正常菌落而不出现微小菌落，这说明有关的两个突变型没有互补作用，是基因重组。如果出现流产转导，说明有基因互补现象存在。,一系列组氨酸缺陷型通过基因重组测验所测得的位置。凡是属于同一顺反子hisB或hisC的突变型(例如，hisB79和hisB14，或者hisC43和hisC62)之间的转导中都不出现流产转导子，凡是属于不同顺反子的突变型(例如，hisB40和hisC43)之间的转导中都出现流产转导子。 另外又发现全部hisB突变型的脱水酶 都是有缺陷的，全部hisC突变型的转氨基酶 也都是有缺陷的。,在沙门氏菌中曾经应用流产转导观

17、察了许多需要同一氨基酸的突变型之间有没有流产转导子出现，从而判断它们是否属于一个顺反子。凡是属于一个顺反子的突变型都是由于同一种酶发生了缺陷，也就是说所丧失的是同一功能。,3 F因子转导测验,一个乳糖发酵缺陷型大肠杆菌F-细菌获得了一个F-lac+就成为一个半合子。F-lac+难得整合到宿主染色体上或和宿主染色体发生交换，所以可以用来进行互补测验。 在大肠杆菌K12中曾经得到了一系列乳糖发酵缺陷型，通过F因子转导互补测验可以看到它们分属于不同的顺反子。,大肠杆菌K12 中获得y、z和O三个突变型，指示性培养基中含有链霉素。滴上去的细菌对链霉素敏感，但是它们的F-lac还是能进入涂在培养皿上的抗

18、链霉素细菌中。经培养以后，通过观察这些半合子能否发酵乳糖就可以看到它们能不能互补，从而测定每个突变型所属的顺反子。,z和y突变型能进行互补，而Z1和Z4以及Yp和YR则不能互补。由此可见Yp和YR属于一个顺反子，Z1和Z4则属于另一顺反子。D和y以及z都不能互补。,三、基因内互补和互补群,属于同一基因的两个突变型不能互补，如果两个突变型能够互补，就说明它们属于两个基因。 但是存在着一些例子，这些突变型应该是属于同一基因，因为它们都能引起同一种酶的缺陷，可是这些突变型能互补。这一现象是顺反位置效应的例外情况，这便是基因内互补.,1 活体互补和离体互补,基因内互补也可以通过异核体的生长情况来检验。

19、在粗糙脉孢菌中有一系列谷氨酸脱氢酶发生缺陷的突变型。它们都是属于同一基因的突变型。 把这些突变型的分生孢子两两混合接种在基本培养基上，就可以看到在某些组合中能得到能在基本培养基上生长的异核体，这就是一种基因内互补现象。,突变型用线段表示，不相重叠的突变型是能互补的突变型。 2和19的行为相同，画在同一线段上， 2和19对于14都有微弱的互补作用，用局部重叠线段表示。,在粗糙脉孢菌的泛酸( 缺陷型pan2)中曾经进行过广泛的基因内互补研究。在这些突变型中清楚地看到它们的排列基本上符合于由经典的重组分析测得的排列顺序.,从粗糙脉孢菌的am突变型的异核体中抽提谷氨酸脱氢酶，从酶活性的测定中可以看到具

20、有互补作用的异核体中确实有或多或少的GDH酶活性，这是离体互补的实验结果,在粗糙脉孢菌的腺嘌呤突变型的研究中，可以明显地看到两个突变型的突变位点愈近，它们的抽提物的混合液中出现的酶活性就愈低，反之距离愈远则活性愈高，活性最高大约占野生型酶活性的25,2 重叠基因,噬菌体174是一种单链DNA噬菌体。一共有5379对核苷酸，这些核苷酸编码的蛋白质共有9种，遗传学分析同样得到9个顺反子。 这些核苷酸能够编码的蛋白质的总的分子质量据估计应为200 000 Da，可是这9种蛋白质的总的分子质量却有250 000 Da。 遗传学分析和核苷酸序列分析结果：同一核苷酸序列可以编码不止一种蛋白质。,蛋白质D和

21、E为同一核苷酸序列所编码 。而基因D内部的一个核苷酸序列编码蛋白质E。 基因D和基因J的编码也是重叠的。 此外，基因B同样也包含在基因A中，而且基因C的终止密码又和基因D的起始密码重叠。,一 方法概论 1重组体系 两个基因的距离一般是通过杂交子代中重组体数量的多少来测定的。两个基因的距离愈近，则需要愈多的杂交子代才能观察到其中出现的少数重组体。 如果所要测定的是两个营养缺陷突变型A和B，那么完全培养基上菌落数和基本培养基上菌落数的比值就是对重组频率的一种测定。,第 三节 基因精细结构分析,2 分辨力 在微生物中遗传学分析能达到怎样的精细程度呢?遗传学分析的分辨力的限制是什么呢? 分辨力的限制的

22、一个主要因素是自发回复突变的干扰。如果所用选择性培养方法是足够灵敏的，而且所用的突变型是比较稳定的，那么这一限制就不存在了。 分辨力的另一限制是实质性的。例如，可以问能允许发生重组的距离究竟有多大。 3 精确度 -基因的精细结构分析很多在不产生有性孢子的微生物中进行。在这些微生物中所进行基因结构分析可以达到非常精细的程度。,1.缺失定位法 2.共转导 3.三点测验 4. 四点测验,四种主要方法,二 分析方法,1.缺失定位法 ：,本法是利用己有的一系列缺失突变株，通过待测突变株与缺失突变株的基因重组试验来确定突变基因位点的方法。,凡是能和某一缺失突变株发生重组的，其突变位点一定不在供试突变株缺失

23、范围内， 因此通过待测突变株与一系列缺失突变株的重组试验结果，可以精确地测定该突变位点的位置。,例: 如有人利用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型的14个缺失突变株来进行未知组氨酸缺陷型的突变位点测定。,通过突变株A与14个缺失突变株的转导实验，发现它与22、2226、2253、644、2652和2614等6个缺失突变株不能得到原养型重组子外，和其它8个缺失突变株均能得到重组子。,结果分析表明突变株A的突变位点应在上述6个缺失突变的共同区域，与6个突变基因没有互补作用。即I的位置.,共转导频率与二个基因间的距离有关，若共转导频率愈高，则基因间的距离愈小；反之若距离愈大，则频率愈低。 因此，可以通过测定

24、二个突变基因的共转导频率来判定它们在染色体上的位置和进行基因的精细结构分析。,2两点测验,在大肠杆菌的色氨酸缺陷型(trp)的重组测验中，用his+trpx作为供体，histrpy作为受体，his是离trp基因座较远的组氨酸基因。 重组通过转导进行，用噬菌体Plkc感染供体细菌，取得所释放的噬菌体，以几倍于受体细菌的噬菌体去感染受体细菌， 然后将受体细菌接种到含有色氨酸的基本培养基上，再测定his+转导子中的trp+转导子数。重组频率可用trp+his+x100表示。 突变型中以A1和A3距离最近，正反转导实验的重组频率是0.006和0.013。,3. 三点测验,用来判定两个突变基因(同一基因

25、不同位点)对于第三个基因位点的排列顺序。 如经重组分析测得A2B3和A2Bl的重组频率十分相近，这时就很难确定以上三个位点的顺序是A2B3Bl，还是A2BlB3,例如已知大肠杆菌的腺嘌呤基因ade和z（lacZ）基因是紧密连锁的，现在要求测定Z基因的两个突变位点ZA和ZB相对于ade基因的位置。 在Hfr（T+L+ ZA-ZB+ ade+ss）F- （T-L- ZA+和ZB- ade-sr）的正向杂交:,假设待测基因与ade基因的排列顺序为ZA-ZB-ade，则要得到乳糖发酵重组子只需发生二次交换即可.,乳糖发酵重组子筛选： 含链霉素、乳糖的基本培养基上筛选。,受体基因型应该是: ?,虚线表示

26、：TL必须要交换，因为乳糖发酵重组子筛选是在含链霉素、乳糖的基本培养基上筛选，这就要求： T+L+, 不能缺陷, 链霉素要求抗性Sr 能够利用乳糖，要求为ZA+ZB+,2. 假设待测基因与ade基因的排列顺序为 ZB-ZA-ade，则要得到乳糖发酵重组子需发生四次交换即可；, Hfr （T+L+ ZA+ZB- ade+ss F- （T-L-ZA-ZB+ ade-sr）进行反向杂交时，其情况则恰恰相反。 Hfr（T+L+ ZA-ZB+ ade+ss）F- （T-L- ZA+ZB- ade-sr）的正向杂交:,1.假设待测基因与ade基因的排列顺序为ZA-ZB-ade，则要得到乳糖发酵重组子只需发生四次交换即可，,2.假设待测基因与ade基因的排列顺序为ZB-ZA-ade则要得到乳糖发酵重组子需发生二次交换即可,根据四次交换频率低于二次交换频率的原则:,如果正向杂交时出现的乳糖发酵菌落多于反向杂交，基因的排列顺序为ZA-ZB-ade。,正向,如果反向杂交时出现的乳糖发酵菌落多于正向杂交，基因的排列顺序为ZB-ZA-ade。,反向,4. 四点测验,拟等位基因：表型效应类似，功能密切相关，在染色体上位置紧密连锁的基因，它们像是等位基因，而实际结构上不等位。,如果在一系列距离相近的拟等位基因突变位点a1，a2，的两端各有一个紧密连锁的基因