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文档简介

1、,PCR基本原理及注意事项,目录,基本原理,常见问题,反应体系,基本原理：,反应体系,10扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2 加双或三蒸水至,10ul200umol/L 各10100pmol 0.12ug 2.5u 1.5mmol/L100ul,有或能加上合适的酶切位点 与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,引物3端的碱基严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基,G C含量以40-60%为宜 ATGC随机分布,避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补,扩增跨度 以200-500bp为宜,15-30bp,引物 设计,酶及其浓度,催化一典型的PCR反应

2、约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),dNTP呈颗粒状，-20C保存,1M NaOH或 1M Tris.HCL 将PH调节 到7.07.5,dNTP质量 与浓度,反应中，dNTP 应为50200umol/L,小量分装 -20冰冻 保存,模板 核酸,DNA 纯化,RNA 纯化,蛋白酶K,SDS,溶解细胞膜 解离核蛋白 与蛋白结合成沉淀,水解消化蛋白质 （组蛋白）,异硫氰酸胍或 蛋白酶K法,Mg2浓度,dNTP浓度为200umol/L时， Mg2 浓度为1.52.0mmol/L为宜,浓度过低会降低Taq DNA聚 合酶的活性，使反应产物减少,浓度过高，反应特异性降低， 出现非特异扩增,常

3、见问题,假阳性,出现片状拖带或涂抹带,出现非特异性扩增带,选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,假阳性,引物设计不合适,靶序列或扩增产物的交叉污染,空气中的小片段核酸污染,整个基因组或大片段的交叉污染,靶序列太短或引物太短,污染解决方法,操作时应小心轻柔,紫外照射,耗材一次性使用,高压消毒,巢式PCR,Mg2+离子浓度过高 退火温度过低 PCR循环次数过多,引物与靶序列不完全互补、 或引 物聚合形成二聚体,酶的质和量,出现非特异性扩增带,解决方法,减低酶量或调换 另一来源的酶,适当提高退火温度或用二温度点法,重新设计引物,降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数,dNTP浓度过高,出现片状拖带或涂抹带,Mg2+浓度过高,退火温度过低,酶量过多或酶的质量差,循环次数过多,：,增加模板量，,减少dNTP的 浓度。适当降 低Mg2+浓度,减少酶量， 或调换另一 来源的酶,解决方法,2

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