第5章荧光分析法与化学发光分析法..ppt

1、1,第5章 荧光分析法与化学发光分析法,5.1 荧光分析法 5.2 化学发光分析法,基本内容,2,相关定义,光致发光：分子、原子吸收光辐射时被激发，然后再发射出与吸收的波长相同或更长光的现象。 荧光：物质分子吸收光子能量被激发后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光。 分子荧光分析法 ：研究物质分子的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法 ，简称荧光分析法 。 化学发光：基于化学反应产生能量来激发分子，分子由激发态回到基态时产生的光辐射现象。,3,特点,荧光分析法：灵敏度高、选择性好 化学发光分析法：灵敏度高；线性范围宽；分析速度快；仪器设备简单，不需要光源及单色器等；没有散

2、射光及杂散光等引起的背景值。,4,5.1 荧光分析法,5.1.1 基本原理 5.1.2 影响荧光强度的因素 5.1.3 荧光分光光度计 5.1.4 分析方法 5.1.5 应用示例,5,5.1.1 基本原理,1分子中电子的激发过程 2分子荧光的产生 3荧光光谱的类型和特征,6,1分子中电子的激发过程,7,2.分子荧光的产生,振动弛豫 内部能量转换 荧光发射 外部能量转换 体系间跨越 磷光发射,8,3荧光光谱的类型和特征,1）激发光谱和发射光谱 2）荧光光谱特征,9,1）激发光谱和发射光谱,10,硫酸奎宁的激发光谱（a） 及荧光光谱（b）,11,2）荧光光谱特征,（1）Stokes位移 （2）荧光

3、发射光谱的形状与激发波长无关 （3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系,12,蒽的激发光谱和荧光光谱,13,蒽的能级跃迁,14,与UV比较,相同点 区段：Vis-UV区 适用性：均可用于定性定量，多用于定量 定量方法：相似 样品性质、量：以液体为主、均少 分析时间：均快 操作难易程度：易,15,与UV比较,不同点,16,5.1.2 影响荧光强度的因素,1荧光效率与荧光产生的条件 2影响荧光强度的结构因素 3影响荧光强度的外部因素,17,(1)荧光效率,激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用f表示： f (01) f 大的有荧光发射,18,（2）产生荧光的必备条件,强紫外-可

4、见吸收 一定的荧光效率 *跃迁 强吸收带 n *跃迁 弱吸收带 存在共轭的*跃迁， f高，荧光强度大。,19,2影响荧光强度的结构因素,(1)共轭效应 (2)分子的刚性与共平面性 (3)取代基效应,20,(1)共轭效应,绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的*跃迁。电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，而荧光波长也长移。,21,苯 萘 蒽, ex 205nm 268nm 356nm em 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.36,22,(2)分子的刚性与共平面性,在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光率越大，

5、并且荧光波长产生长移。,23,(3)取代基效应,第一类取代基：NH2、OH、OCH3、NHR、NR2、CN等 第二类取代基：COOH、NO2、CO、NO、SH、NHCOCH3、F、Cl、Br、I等 第三类取代基：R、SO3H、NH3等,24,3影响荧光强度的外部因素,温度 溶剂 pH值的影响 荧光熄灭剂的影响 散射光的干扰,25,温度和溶剂,温度：温度升高，荧光物质的荧光效率和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小，荧光强度减小,26,pH值的影响,当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为弱酸弱碱分子和它

6、们的离子结构有所不同，在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度有差异。,27,苯胺在不同pH值下有下列平衡关系,苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于-NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。,28,荧光熄灭剂,荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。,29,常见的荧光熄灭剂,卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物 荧光熄灭的形式： a、碰撞、 b、生成不发光配位化合物 c、荧光物质氧化,30,

7、散射光的影响,瑞利散射光 拉曼散射光 干扰荧光测定，应采取措施消除,31,硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱,32,5.1.3 荧光分光光度计,33,1. 激发光源,高压氙灯 强谱线的连续光谱 连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波长之间的谱线强度几乎相等 汞灯 线光谱 高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm,34,2. 单色器,激发单色器-除去不需要的光线 发射单色器-选择不同的荧光发射波长,35,3. 样品池,低荧光的玻璃或石英 方形适用于90测量,36,4.检测器,光电倍增管,3

8、7,5.读出系统,数字电压表 记录仪 带有计算机控制的读数装置,38,5.1.4 分析方法,溶液产生荧光的光路示意图,39,1荧光强度与物质浓度的关系,F=KfI0（1-e-bC） K仪器常数，f激发光强度 当C很小时，A=bC0.05时， e-bc=1-bc F=kfI0bC=KC,40,2定量分析方法,标准曲线法 比例法 多组分混合物的荧光分析,41,3荧光分析新技术简介,（1）激光荧光分析 （2）时间分辨荧光分析 （3）同步荧光分析,42,5.1.5 应用示例,1无机离子的测定 与有机试剂形成配合物后进行荧光分析，测定方法常用直接荧光法或荧光熄灭法。 2有机化合物的测定 具有高度共轭体系

9、的脂肪族化合物（如维生素A、胡萝卜素等）和芳香族化合物 药物中的胺类、甾体类、抗生素、维生素、氨基酸、蛋白质、酶,43,5.2 化学发光分析法,5.2.1 基本原理 5.2.2 发光反应主要类型 5.2.3 化学发光的测量仪器 5.2.4 分析方法 5.2.5 应用与示例,44,5.2.1 基本原理,化学发光是基于化学反应提供的足够能量，使其中一种反应产物的分子的电子被激发，形成激发态分子，当它们从激发态跃回基态时，就发出一定波长的光。,45,化学发光的反应式,反应式表示为： A + B C* + D C* C + hv 其中，C*是产物C的激发态（下同）。,46,化学发光反应的基本条件,化学

10、发光包括吸收化学能和发光两个过程，要产生化学发光现象，必须满足以下条件： （1）化学发光反应必须提供足够的化学激发能，以引起电子激发。 （2）激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热的形式消耗能量。 （3）激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热的形式消耗能量。,47,化学发光效率,48,5.2.2 发光反应主要类型,1气相化学发光 2火焰化学发光 3液相化学发光,49,1气相化学发光,（1）臭氧的反应 臭氧可与40余种有机化合物产生化学发光反应 （2）氮氧化合物的反应 一氧化氮与臭氧的气相化学发光反应有较大的化学发光效率 （3）氧原子的反应 气相中的SO2、NO、NO2及CO

11、等能与氧原子产生化学发光反应,50,2火焰化学发光,火焰化学发光是在300400的火焰中，热辐射是很小的，某些物质可以从火焰的化学反应中吸收化学能而被激发，从而产生火焰化学发光。火焰化学发光现象多用于硫、磷、氮和卤素的测定。,51,火焰化学发光的类型,（1）一氧化氮的反应 一氧化氮在富氢火焰中燃烧时产生很强的火焰化学发光反应，二氧化氮在富氢火焰中能迅速地被氢原子还原为一氧化氮，因而此法可用于测定空气中NOx的总量。 （2）挥发性硫化物的反应 当挥发性硫化物如SO2、H2S、CH3SH及CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧时，产生很强的蓝色化学发光。,52,3液相化学发光,常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米诺是最常用的发光试剂 。,53,5.2.3 化学发光的测量仪器,1分立取样式 2流动注射式,54,流动注射式化学发光仪示意图 R-试剂载流；S-试液；P-蠕动泵； V-进样阀；D-化学发光检测器,55,5.2.4 分析方法,化学发光分析主要用于定量分析。 1化学发光强度与反应物浓度的关系,56,2常用发光试剂,（1）鲁米诺