转化 (1).ppt

1、感性细胞的制备连接产物转化克隆菌，pETBlue-2适合克隆宿主菌，NovaBlue JM109 DH5a都是具有lacZ M15基因型的受体细菌，lacZM15: lacZ的M15是表达半乳糖酶的基因。M15缺失的时候(很多受体细胞没有自然摄取外源DNA的能力，为此需要经过人工处理)。转化：大肠杆菌捕获质粒DNA的过程；转染：大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程；transduction(转导):通过噬菌体将外源DNA导入细菌的过程。感性(Competence):细菌处于容易吸收外源DNA的状态，或细菌在周围环境中能吸收DNA的生理状态。细菌表面的正电荷增加，细胞壁和膜的渗透性增加，有利于DNA分

2、子的吸附和吸收。转换：二元DNA分子引入受体细胞的过程致敏过程：是化学诱导细胞进入感应状态的过程，1、化学试剂方法(CaCl2、KCl、MgCl2等)核心：目标细胞浸泡在CaCl2等溶液中的过程几乎切换条件：2.5 KV/0.2cm，Ca2柔道完全细菌细胞的切换，CaCl2法对孟德尔和海尔(1970)的发现，0价阳离子Ca2，Mg2，细菌0度，2价阳离子CaCl2存在的低渗透溶液中，这时混合物的外源DNA发生了变形，抗重组DNA加热在42度的短暂热冲击下吸附在细胞表面，进入细胞。在丰富的培养基中生长几个小时后，球形细胞恢复原状，繁殖。转换的确切机制还不清楚。简单、可靠、重复性高。转换效率为10

3、5106/ugDNA，细菌，42，370C，190rpm振动培养会熬夜2.将0.8mL字典培养菌液转移到含有12.5ug/mL Tet的35mL LB液体培养器的锥子上。370C，250rpm振动培养2.5-3小时(OD600.4-0.5，活冰上10min 4)。释放40C、4000rpm、离心10min 5。出培养液，倒置管，培养油类6。在菌体中加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 10mL，用5 mL的枪头轻轻吹出菌体，冰浴为30min。动作轻！冰浴！7。40C，4000rpm，离心5min，足够上清8。加入冰预冷的0.1毫升质粒DNA 2uL(550ng)(阳性对照)，取200uL诱

4、导细胞，加入200uL无菌水(阴性对照)，加入200uL 0.1 mol/L的CaCl2，加入连接产物2uL(阴性对照)，用枪头轻轻搅拌、转换、1。小心：无菌！动作轻！冰浴！2 .42度水浴热冲击90秒3。冰浴2分钟恢复每管800毫升液体培养基，37度慢慢30分钟到1小时(150rpm)，恢复目的？注：无菌！动作轻！冰浴！高温！复苏：细菌在非选择性培养基中保温一段时间，以表达恒星，然后转移到含有恒星的选择性培养基中。生长的菌落是转移到外源基因的菌落。在牙齿期间铺板，选择性筛选的话，吸出复苏菌液4000r/min离心分1min，先吸出900uL上清，然后将细胞分散到细胞显液中，反过来培养，直到液

5、体全部被吸收，过夜(37度)，使用Carb Tet，IPTG Xgal，涂布机LB液体培养基120mL胰白酮1.2g酵母提取物0.6g NaCl 1.2g首先添加120mm，2个35mL 250mL锥形瓶，其余为大试管(4mL/管)2LB固体培养基200 mL LB液体培养基中含有1.2的琼脂，灭菌后温度下降到60左右，加入50ug/mL Carb，12.5UG/ML，立即放入8个平面3。0.1mol/L的CaCl2 50mL组，不溶解，全部为最终浓度，灭菌试剂13 2。小指管：1.5毫升40个3。总标题：200uL 1盒1mL 1盒5mL 8 4。50毫升(筛选菌株2管/人，抗生素)，下周筛

6、选：每人2个单糖(白班)，每个组1个蓝点，pETBlue System:青白筛选：他拥有的大肠杆菌Tet启动子弱组成型启动子，下游PETblue系统可以选择NovaBlue (CE6，表示PL启动子驱动的T7RNA聚合酶的噬菌体)或TunerTM(DE3)pLacI菌株作为宿主菌。牙齿宿主基因组包含lacUV5启动子控制T7RNA聚合酶基因，可以实现IPTG诱导。低本底表示：由于T7-lac启动子驱动的外原油电子的表达方向与Tet启动子驱动的LacZ-片段表示的方向相反，牙齿系统中几乎没有外原油电子的本底表示。表达，TunerTM菌株是BL21的lacZY缺失突变株，可以同时调节同一培养体系内

7、所有细胞的蛋白质表达水平。多亏了Lac通透酶(lacY)突变，IPTG能够均匀地进入群体中的所有细胞，获得浓度依赖、水平均匀的诱导。通过更改IPTG浓度，可以将表示从非常低的级别控制到非常强大且完全诱导的表示级别(常用的pET托架和相关)。低水平的表达会增加难以表达蛋白质的可溶性和活性。Tuner(DE3)pLacI菌株可与pETBlue和pTriExTM载体配合使用。NovaBlue是适合用作早期复制宿主菌的K-12菌株，recA endA突变促进了高转换效率、蓝色/白斑过滤功能(使用相应质粒)和质粒DNA的高产量。由于存在f附加编码的lacIq抑制蛋白，NovaBlue的DE3溶原菌是一种

8、非常有用的严密宿主菌。BL21是应用最广泛的宿主菌源，具有lon和ompT蛋白酶缺陷的优点。(DE3)宿主菌是lDE3溶原菌，染色体包含由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。牙齿菌株与pet载体一起表达。PLysS是对可与pET共存的T7溶菌酶(T7 RNA聚合酶的天然抑制物)进行编码的质粒。PLysS菌株在诱导前抑制了T7 RNA聚合酶的基本表达，从而使影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主内更加稳定。PLacI质粒宿主细菌产生其他lac抑制蛋白，抑制pETBlue和pTriEx向量的基本表达。预计结果，PV0V1V1M，2000BP，1000BP，750BP，500BP，250BP，100BP，酶产品的琼脂糖传记电泳(1%)，P3360双酶切PCR产品；V0:没有酶的质粒；V1:不完全酶切质粒；V1:全酶切质粒；M:分子量标准(DL2000)，1 2 3 4 5 6 8 9，1 2 3 4 5 6 8 9 10 12 13，酶产物的琼脂糖传记电泳(1%