2发酵工业菌种.ppt

1、第二章发酵工业菌种，一，常用工业微生物二，发酵工业菌种筛选原则和基本技术三，发酵工业菌种改良，最常用工业微生物，细菌醋杆菌属醋化醋杆菌，弱酸化醋杆菌乳酸枯草杆菌丙酮丁醇梭大肠杆菌谷氨酸棒杆菌， 最常用的工业微生物酵母菌酿造酵母念珠菌属产朊假丝酵母、解脂念珠菌、热带念珠菌红酵母属、汉森酵母属、最常用的工业微生物、霉菌属曲霉属青霉：点青霉、产黄青霉菌根霉属德氏根霉菌曲霉属紫红霉、 最常用的工业微生物放线菌链球菌属被孢霉属地中海诺卡尼汀属的迷你游走放线菌，是指尚未培养微生物，定义：迄今采用的微生物纯培养分离及培养方法尚未得到纯培养的微生物，在自然环境微生物群落中占很高比例，约99。 研究方法自然培养

2、法：原位培养，培养条件优化，单细胞操作宏基因组分析法，二，发酵工业菌种分离筛选的原则和基本技术，(一)发酵工业菌种分离的总趋势和要求，(二)分离筛选的原理和技术，(三)应用实例，一)菌种选择的总趋势，野生生长速度和反应速度快， 发酵周期短，培养条件容易控制，抗噬菌体和杂菌污染，2 .对菌种选择的要求(续)，对菌种不易变异退化的扩增装置适应性高的菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素。 (二)分选原理和技术，1 .分选指导思想2 .分选工作实际应用的几个方面3 .新的分选原理和技术，1 .分离纯化分选的两种指导思想，然后按工艺要求进行分选。 分离纯化同时富于筛选条件，进一步得到了所需菌株

3、。 结果有两种可能：得到适合工业发酵的菌株，只得到选育所需的起始菌株，2 .分离筛选工作在实际应用的几个方面， 从受污染的生产和科研用菌中分离目标菌寻找生产中长期使用菌种的定期分选从用各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适合工业目的的优良菌株的已知菌种和从大自然中分离新菌株的新发酵产品的生产菌的旧产品的新优良菌株。从保存机制中取出菌种进行分离筛选有两个优点：经济指导性、筛选方案设定时必须考虑两个要点、选择灵敏度、3 .新的分离和筛选步骤。 调查研究(包括资料检索)试验方案分离设置和校准含微生物样品采集的样品预处理(如何在后续操作中实现这种可能性)菌种，根据目标菌株及其产物特征选择性分离方法(

4、选择性筛选选择性压力) (筛选方案-检测系统间接分离) 菌种纯化的初步工艺条件是探索再筛生产性能试验优良的菌株1-3株的保存和进一步生产试验所需的试验和作为育种起始菌株的毒性试验等，微生物样品的采集， 取样时应注意的问题：土壤微生物的分布采土深度土壤植被状况取样季节土壤的酸碱度对于新菌种的分离筛选还存在另一个选择标准：土壤源在适应相当严峻的环境压力的微生物群中寻找新菌种，进行样品的预处理， 目的提高分离效率的方法：物理方法热处理膜过滤法离心法化学诱饵法、分离方法的选择、目的根据菌种有无选择性的分离方法菌种的营养特征、独特的生长特征、独特的无选择性的特征生成物的特征进行随机分离选择性分离的关键：

5、根据生长培养条件的选择和控制进行定向富集筛选选择性分离、选择性分离原理和技术、生长条件的选择和控制原理营养成分控制培养基的酸碱度添加抑制剂控制培养温度控制通气条件选择性分离技术液体培养技术固体培养技术、施加选择压力进行定向筛选， a .富集液体培养增加混合菌群所需菌株数量的技术特点之一：为混合菌群提供有利于目标菌株生长和非目标菌型生长的条件培养方式：以最大比生长速度(max )筛选，控制选择压力，移动时间和次数等存在问题的连续培养方式：以比生长速度()筛选，、 连续浓缩培养技术分离菌株的优点，分离的菌株特别是有利于分离具有连续发酵生产过程的工业生产特性的菌株，能够筛选出可以共生的稳定的混合培养

6、物，b .常用于固体培养技术，某些酶产生菌的筛选压力的分离：在选择培养基中加入必要的酶基质，随机分离原理和技术， 从产物开始，建立高产培养基，建立快速敏捷的专业筛选方法的技术重要：产物合成条件的选择和控制以及相应的筛选方法的确定。 随机分离技术是抗生素产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选多糖产生菌，以修订高产培养基的一些原则为例制造一系列培养基， 确认其中含有各种养分成为生长限制因子的一个聚合或复合形式的生长限制养分，避免使用容易同化的碳源或氮源，防止代谢物的分解阻碍的必要亚因子(Co2，Mg2，Mn2，Fe2)。 为了降低pH变化，采用了使用pH缓冲剂的前体、促进剂及抑

7、制剂。抗生素产生菌的筛选、筛选模型：试验菌筛选方法：敷菌法拷贝平板法液体培养筛选耐药性筛选模型：氨苄青霉素和内酰胺酶产生菌(克雷伯菌)为无试样时(不含糖酸时)，为菌不多试验菌代表微生物类型金黄色葡萄球菌209p革兰氏阳性球菌枯草杆菌6633革兰氏阳性杆菌大肠杆菌革兰氏阴性肠道细菌耻垢分支杆菌607结核杆菌念珠菌真菌青霉菌丝状真菌、药理活性化合物产生菌的筛选，药理活性化合物是指能够抑制人代谢的任一重要酶的微生物产物的酶抑制剂，达到了治疗的目的。 筛选模型：目的酶、生长因子产生菌的筛选、筛选模型：营养缺陷型试验菌的筛选方法：分离微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌的生长， 氨基酸产生菌的筛选其中产生

8、氨基酸的菌落分泌氨基酸对应于copy前的相应u.v射线杀灭长菌落的位置，发现目标菌落并在含有营养缺陷型试验菌的琼脂培养后的氨基酸产生菌落周围铺设生长圈的菌落进行液体培养，定量地培养生成物细菌分离：以乳酸菌为例，将麦芽汁从1g未成熟的味醅样品放入无菌磨口瓶中密封在瓶口，在25培养24-48h培养基中使丝线状波动物生长，镜检棒状、阳性染色用2-3代稀释分离法将乳酸菌分离为单菌落，培养基为麦芽汁，培养基为乳酸纸色谱法检测Rf值定性(有机酸呈黄斑)乳酸生成量测定(滴定法)、放线菌的分离：以链霉素产生菌种的分离为例(从退化菌种中筛选)，取工业发酵液(含孢子)样品1环，放入装有玻璃珠的无菌水的小三角瓶中，

9、采用稀释法平板的目的菌落扩大培养、发酵液性能测试真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例，将发酵液稍微稀释10倍，用10-1-10-7稀释分离法将0.1ml装入固体培养基中，将皿放平(2)，在麦芽汁固体培养基中培养25种48-72h形态筛选，采用基于正常株特征的平板分离法进行进一步纯化， 产生至少三次子囊孢子的速测发酵力测定性能测定热死温度测定凝聚力测定二乙酰含量测定、菌种选育改良的具体目标、提高目标物的产量、提高目标物的纯度、减少副产物、改善菌种性状、改善发酵过程、改变生物合成途径， 获得高产新产品的发酵工业菌种改良方法，基于常规育种(突变育种)细胞工程育种代谢调节的育种技术基因工程育种蛋白质工

10、程育种代谢工程育种，赖氨酸生产菌种的选育改良构想出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌， 乳糖发酵短杆菌育种构想1 .优先合成的转化渗漏缺陷型的选育2 .支路代谢营养缺陷型的选育3 .同丝氨酸缺陷型3 .抗结构相似物突变株的选育4 .代谢互锁解除： Leu-、抗Leu结构相似物、喹啉s -苯醌s 5.增加前体的合成和堵塞副产物的生成适合抗Asp结构类似物选育的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株6 .改善细胞膜透过功能7 .温度敏感性突变株8 .应用细胞工程和基因工程育种，选育适合的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株赖氨酸合成中间代谢， TCA环氧化葡萄糖丙酮酸醋酸天冬氨酸残奥酸赖氨酸磷酚丙

11、酮酸羧化反应葡萄糖磷酚氧化乙酸天冬氨酸残奥海冬氨酸残奥丙酮酸赖氨酸、代谢工序的定义、用多基因重组技术修饰细胞代谢路径细胞特性的改变并结合细胞基因调控、代谢调控及生化工程，构建新的代谢途径，实现为生产特定目标物而发展的新学科领域。 也称为路径工程学，是多基因的基因工程学。 代谢工程学发展的基础代谢网络理论：不是孤立地考虑细胞的生化反应，而是从整个网络来考虑。 代谢网络分流中的代谢产物称为节点，其中对最终产物的合成起决定性作用的少数节点称为主节点。 根据节点下游分支的可变程度，节点被分为灵活的节点，通过解除一个分支的反馈抑制，能够提高该分支下游生成物的生产量。 半柔性节点：在降低主支的酶活性的同时

12、，必须提高次支的酶活性或解除反馈抑制，才能提高次支下游产物的产量。 刚性节点：其下游各分支的比例不易变化。代谢工程发展的基础、依赖网络：代谢网络的各主节点集中在产物上，为了避免中间物的过度积累，各分支的代谢流需要保持平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。 独立网络：代谢网络的主节点不集中，可以通过对代谢的修饰影响生成物的产量，其对代谢修饰的响应能力取决于各节点的刚柔性及其位置。 (3)代谢工程育种思路；(1)改变代谢流：改变分支代谢途径，阻断有害代谢产物的合成。 (1)加速限速反应(2)改变分支代谢途径的流动：增加具有代谢分支点的分支代谢途径酶系活力，占与另一分支代谢途径竞争的优势，可提高目的代谢端产物产量. (3)建立代谢旁路(4)改变能量代谢途径，改变代谢工程育种的思路，(2)扩张代谢途径(1)导入外源基因后，将原代谢途径延长到后方，产生新的末端代谢产物。 (2)使传统代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢端产物。 代谢工程育种思路，3 .转移或构建新的代谢途径1 )转移代谢途径：为了生产某种新化学结构的代谢产物，将催化某种代谢途径的基因组克隆到另一种不具有这种能力