酶工程_05-酶分子修饰-2012.ppt

1、酶 工 程Enzyme Engineering,第 五 课 酶 分 子 修 饰 Modification of Enzyme Molecules,酶 分 子 修 饰,什么是酶分子修饰 酶分子修饰（enzyme molecular modification） 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程 酶分子工程（enzyme molecular engineering） 指按照酶的各种特性的需要，依据结构性能间的关系，在分子水平上实现酶的结构设计和操作 分子生物学水平：用基因工程方法对 DNA 或 RNA 进行分子改造，以获得化学结构更合理的酶蛋白 一级结构水平：对

2、天然的酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等,?,酶 分 子 修 饰,对酶进行分子修饰的原因和依据 在非生理条件下，酶的某些性质不满足工程应用 生理最适温度、pH 值 体外最适温度、pH 值 酶分子对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性较差 酶在非生理条件下活力下降，抗原性显著 理论依据和方法 酶的结构特点与酶催化特性的关系：构效关系 理性设计（rational design）：找出关键结构，在掌握酶的构效关系的基础上，有目的地对其进行改造 半理性设计（semi-rational design）：以基因的随机重组为手段，参考酶的构效关系进行关键位点的改造,酶 分 子 修

3、 饰,酶分子修饰的意义：我们究竟要做什么？ 应用角度 酶工程 提高酶的催化效率，改变底物专一性 增强酶的稳定性，降低 / 消除酶的抗原性 研究角度 酶学 研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探索酶的结构与催化特性之间的关系 探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态 探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动 探索酶的作用机理和催化反应历程,催化特性,环境适应性,酶 分 子 修 饰,酶分子修饰的条件 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维持酶活性功能的必需基团 pH 值与离子强度 决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态 修饰反应的温

4、度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应 反应体系中酶与修饰剂的比例 控制二者的比例，防止酶的过度修饰而导致的活性完全丧失,酶 分 子 修 饰,酶 分 子 修 饰,化学修饰的方法学,揭示了蛋白质必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系 邹氏作图法 袁勤生,现代酶学p139,酶 分 子 修 饰,化学修饰的方法学,酶 分 子 修 饰,酶分子修饰的种类 金属离子置换修饰（重点） 大分子结合修饰（重点） 侧链基团修饰（重点） 亲和修饰 肽链有限水解修饰（重点） 核苷酸链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 核苷酸置换修饰 酶分子的物理修饰 酶的定向进化修饰,酶 分 子 修 饰,金属离子

5、置换修饰 Metal ion substitute modification 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法 通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制 适用对象：金属酶（metalloenzyme） 一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为 辅因子 金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起稳定作用 金属酶纯化时仍保留着定量 的功能金属离子,酶 分 子 修 饰,金属离子置换修饰 常见的金属酶及其离子种类 -淀粉酶 Ca2+、Mg2+、Zn2+ 谷氨酸脱氢酶 Zn2+ 过氧化氢酶 Fe2+ 酰基氨基酸酶 Zn2+ 超氧化

6、物歧化酶 Cu2+、Zn2+ 细胞色素 P450 单加氧酶 Fe2+ 固氮酶 Fe(II)、Mo(IV) 谷胱甘肽过氧化物酶 Se(IV) 主要的金属离子 Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等,Cyt P450,酶 分 子 修 饰,金属离子置换修饰 金属离子置换修饰的方法 酶的提纯 除去原有金属离子 加入金属螯合剂，如 EDTA 等，让酶分子中的金属离子与 EDTA形成螯合物 透析、超滤或层析除去螯合物 加入置换的离子 加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合 用透析或层析等方法除去未结合的离子,酶 分 子 修 饰,金属离子置换修饰 金属离子置换修饰的作用 阐明金属离子对酶催化作用的

7、影响 一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶 / 辅基可逆结合，从而起到催化作用 提高酶的催化效率 将 Zn 型-淀粉酶置换成 Ca 型，活力可提高 20%30% 增强酶的稳定性 Fe-SOD 置换成 Mn-SOD 后稳定性增强，对 NaN3 敏感性降低 改变酶的动力学特性 酰化氨基酸水解酶活性部位的 Zn 被 Co 置换后，酶的底物专一性（Km 值）和最适 pH 都显著改变,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 Macromolecules combine modification 采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法 常用的大

8、分子 糖、糖的衍生物 聚乙二醇（PEG） 含 C=C 双键单体聚合得到的聚合物 多肽链，甚至蛋白质,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 大分子结合修饰的方法 选择修饰剂 选择溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、无毒的大分子 聚乙二醇（PEG）、寡聚糖、多糖及其衍生物等 修饰剂的活化 将修饰剂分子中的基团（OH）转化为高反应性的基团 修饰反应 将活化过的修饰剂与纯化的酶液按照一定比例混合反应，控制温度、pH 等条件 分离 层析分离，除去多余的修饰剂,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） PEG 既可溶于水，又可溶于多种有机溶剂 微毒

9、或无毒 免疫原性低 生物相容性好，已通过 FDA 认证 分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大 末端有两个能被活化的 OH 基团 为了获得单功能的PEG，将其中一个羟基转化为烷氧基，即单甲氧基聚乙二醇（MPEG）,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 MPEG 三氯均三嗪活化法（重点掌握）,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 MPEG 叠氮法：将OH转化为N3 基团,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 MPEG 琥珀酸酐法（溴代或碘代琥珀酸酐）,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 MPEG 重氮法：将OH转化为N=N 基团,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰

10、修饰剂 右旋糖酐（dextran） 右旋糖酐是由葡萄糖通过 -1,6-糖苷键 形成的高分子多糖 水溶性较好 生物相容性好 糖链上的 2,3-双羟基 经活化后可与酶分子中的氨基结合,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 右旋糖酐 溴化氰（CNBr）法：糖酐活化,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 右旋糖酐 溴化氰（CNBr）法：与酶偶联,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 右旋糖酐 高碘酸（HIO4）氧化法,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 右旋糖酐 高碘酸（HIO4）氧化法：增加连接臂,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 肝素（heparin） 由 D-

11、葡萄糖醛酸（或 L-艾杜糖醛酸）和 N-乙酰氨基葡萄糖形成重复二糖单位组成的多糖 在体内外都有抗凝血作用 临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 肝素 碳二亚胺法（COOH 反应）,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 修饰剂 肝素 三氯均三嗪法,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 大分子修饰的作用 提高酶的催化效率 根本原因：改变了酶的空间构象，有可能促使酶活性中心与底物更容易结合 酶的催化功能是由其空间结构决定的 例1：1 分子核糖核酸酶与 6.5 分子右旋糖酐共价结合，活力提高到原有的 2.25 倍

12、 例2：1 分子胰凝乳蛋白酶与 11 分子右旋糖酐共价结合，酶的催化效率提高到原酶的 5.1 倍,位阻效应,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 大分子修饰的作用 增强酶的稳定性 水溶性大分子与酶结合，在酶分子外层形成保护层，可以保护酶的空间构象 不溶性大分子与酶结合，形成固定化 酶，也提高酶的稳定性 稳定性的表征 半衰期 酶的半衰期：酶活力降低到原来活力一半时所经过的时间,酶 分 子 修 饰,大分子结合修饰 大分子修饰的作用 降低或消除抗原性 酶非经口（如注射）进入人体后，会成为一种抗原，刺激体内产生抗体；当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去催化功能 经过大分子

13、修饰，酶蛋白的空间结构发生改变，致使酶蛋白与抗体之间不再发生特异性识别，从而降低了酶蛋白与体内抗体的结合几率 例如：L-天冬酰胺酶 EC 3.5.1.1 经 PEG 修饰后抗原性显著降低，已经在 1994 年被 FDA 批准用于治疗急性淋巴性白血病,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 Side residues modification 采用一定的（化学）方法，使酶蛋白侧链基团发生改变，从而改变酶催化特性的修饰方法 用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响 荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象 各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成 对非催化基团修饰可改变酶的

14、动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力 利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量 改变酶的结构和催化性能,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 两类酶的修饰 蛋白类酶 侧链基团可组成各种次级键对蛋白质空间结构的形成和稳定起重要作用，而当这些功能基团发生改变，引起次级键改变，使空间结构发生某些变化，从而引起酶特性和功能的改变 亲核性侧链基团：OH、COOH、NH2、SH、咪唑环 亲核性取代的氨基酸残基: Ser、Cys、Asp、Thr、Lys、His 等 亲电性侧链基团：芳香环、吲哚环 亲电性取代的氨基酸残基: Tyr、Trp 核酸类酶 磷酸基，核糖糖环上的OH、碱基杂环及其NH2、OH等,酶 分

15、子 修 饰,侧链基团修饰 几种重要的修饰反应 酰基化 OH（Ser、Thr、Tyr）、SH（Cys）、NH2（Lys） 烷基化 多种基团均可发生，包括芳环和杂环 氧化和还原 酚基、SH、杂环等 芳香环取代 涉及 Phe、Tyr、Trp 等几种芳香族氨基酸 其他反应，如 CNBr 裂解反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 各类侧链基团的修饰 氨基修饰（Lys） 羧基修饰（Asp、Glu） 巯基修饰（Cys） 胍基修饰（Arg） 羟基修饰（Ser、Thr、Tyr） 咪唑基修饰（His） 吲哚基修饰（Trp） 甲硫基修饰（Met） 分子内交联,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 1. 氨基（NH2）

16、修饰的主要特点 氨基在酶蛋白中主要是 Lys 的 -NH2 和肽链末端氨基 非质子化的 -NH2 亲核反应活性很高，易被选择性修饰 一般情况下 -NH2 的 pKa = 10，其解离程度取决于微环境 氨基的修饰反应主要有酯化、N-烷基化等,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 氨基 酰化反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 氨基 TNBS 反应和 Sanger 反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 氨基 N-烷基化,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 2. 羧基（COOH）修饰的主要特点 羧基在酶蛋白中主要是 Asp 和 Glu 的 侧链 COOH，以及肽链的末端羧

17、基 在水溶液中，COOH 通常解离成负离子，亲核性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、成酰胺反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 羧基 碳二亚胺反应（羧基修饰的标准方法）,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 羧基 酯化反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 3. 巯基（SH）修饰的主要特点 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的 -SH 巯基的亲核性强，往往是酶分子中反应活性最高的基团 巯基容易被氧化成 SS，在维持蛋白亚基之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用 巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修饰产物,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 巯基 二硫键置换反

18、应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 巯基 与含汞有机物的反应（SH 对 Hg 的亲和力很强）,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 巯基 S-烷基化反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 4. 胍基（N=C(NH2)2）修饰的主要特点 胍基存在于酶蛋白的 Arg 残基侧链上 在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用 胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般采用具有两个邻位羰基的化合物，在中性或弱碱性条件下反应，一般是可逆反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 胍基（与邻二酮的反应）,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 5. 酚基和羟基（OH）修饰的主要特点 酶蛋白

19、中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、Tyr 羟基的专一性修饰较困难，通常修饰剂能同时修饰羟基、氨基和巯基 Tyr 的酚羟基相比于 Ser 和 Thr 的羟基要活泼一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性，能发生亲电取代反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 酚基和酚羟基 酚基亲电取代反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 （酚）羟基 O-酰基化反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 6. 咪唑基修饰的主要特点 咪唑基存在于酶蛋白的 His 残基侧链上 His 是多种酶的活性中心，是电荷中继网中的重要成员 对 His 咪唑基的修饰，一般是通过 N-烷基化或 C-亲核取代来进行

20、 对咪唑进行修饰后，酶活性一般会受到显著影响,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 咪唑基 N-取代反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 咪唑基 杂环上的亲电取代反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 7. 吲哚基修饰的主要特点 吲哚基存在于酶蛋白的 Trp 残基侧链上 Trp 残基疏水性较强，一般位于酶分子的内部，反应活性比氨基和巯基差，因此对其修饰较困难很多能与吲哚基反应的试剂，一般优先与巯基或氨基反应 有时候 Tyr 会对吲哚基的修饰产生干扰,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 吲哚基 与 Koshland 试剂的反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 8. 甲

21、硫基修饰的主要特点 酶蛋白中 Met 残基中的硫以硫醚的形式存在 硫醚中的硫原子虽然具有亲核性，但反应活性较差，在温和的条件下一般不发生反应 硫醚的主要反应主要是氧化反应，产物为砜和亚砜；另外，采用某些试剂也可以进行 S-烷基化反应,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 修饰反应 甲硫基,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 9. 分子内交联（掌握概念） 采用双功能基团化合物（双功能试剂），在酶分子中对空间距离较近 的两个氨基酸残基侧链基团之间进行共价交联,酶 分 子 修 饰,侧链基团修饰 分子内交联试剂 同型、异型 可裂解、不可裂解,酶 分 子 修 饰,亲和修饰 Affinity modificat

22、ion，酶的专一性修饰 试剂作用于特定部位的某一基团，而不与这一部位之外的同类基团反应 用于酶化学修饰的试剂，即使对某一基团反应是专一的，也仍然有多个同类残基与之反应，因此对某个特定残基的选择性修饰比较困难，为了解决此问题，开发了亲和标记试剂 这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂，一般具有与底物相似的结构，对酶活性部位具有高度的亲和性，可专一性标记于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也称专一性不可逆抑制剂,酶 分 子 修 饰,亲和修饰,酶 分 子 修 饰,亲和修饰 亲和标记试剂的特点 在使酶不可逆失活以前，要与酶形成可逆复合物 亲和试剂的修饰程度是有限的 竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率 亲

23、和试剂体积不能太大，否则造成较大的空间位阻 修饰产物应当稳定，应便于表征和定量,酶 分 子 修 饰,亲和修饰 KS 型（竞争性标记试剂） 根据底物的结构设计的，具有与底物结构相似的结合基团，同时还具有能与酶活性部位氨基酸侧链反应的活性基团 特点 底物、竞争性抑制剂及其他结构类似物对修饰具有保护作用 修饰反应是定量定点进行的 Kcat 型（自杀性标记试剂） 根据酶催化过程设计，专一性很高 具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团在酶催化下活化，与酶活性部位氨基酸侧链发生反应，不可逆地结合,酶 分 子 修 饰,肽链有限水解修饰 Peptide chain limit hydrolysis modi

24、fication 在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生精细改变，从而改变酶催化特性的修饰方法 肽链是蛋白类酶的主链，是酶分子结构的基础 活性中心的肽段是酶催化作用必不可少的 活性中心之外的肽段维持酶的空间构象 肽链被水解后可能出现的情况 酶活性中心破坏，酶失去催化功能 探测酶活性中心位置 酶活性中心构象完整，酶活力保持不变或损失不多，但抗原性发生变化 提高酶的药用价值 活性中心形成，与底物结合能力提高并形成准确的催化部位 酶催化功能增强或酶活力提高,酶 分 子 修 饰,肽链有限水解修饰 酶蛋白主链修饰 酶切 / 酶原激活法 胃蛋白酶原（pepsinogen）的自激活 意义：保护作用，避

25、免了过量的胃蛋白酶对胃壁自身进行消化,酶 分 子 修 饰,肽链有限水解修饰 酶蛋白主链修饰 酶切 / 酶原激活法 胰蛋白酶原（trypsinogen）的水解激活,利用胰蛋白酶或肠激酶从 trypsinogen 的 N-端切除一段六肽序列：N-Val(Asp)4Lys,酶 分 子 修 饰,肽链有限水解修饰 酶蛋白主链修饰 酶切 / 酶原激活法 胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,酶 分 子 修 饰,肽链有限水解修饰 酶蛋白主链修饰 酶切 / 酶原激活法 Klenow 片段：基因工程的工具酶,E.coli DNA 聚合酶 I 经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的 C-末端

26、 605 个氨基酸残基片段。 保留了 DNA 聚合酶 I 的 5 3 聚合酶和 3 5 外切酶活性，但缺少完整酶的 5 3 外切酶活性。,酶 分 子 修 饰,核苷酸链剪切修饰 Nucleotide chain cleavage modification 仅见于 R 酶的分子修饰，指在核苷酸链的限定位点进行剪切，使 R 酶的结构发生改变，从而改变其催化特性的方法 L-19 IVS 的形成 四膜虫（Tetrahymena）26S rRNA 前体自我剪接形成成熟的 26S rRNA，同时生成414 nt 的线性间隔序列 LIVS LIVS 经一系列剪接、环化、开环过程最终得到多功能 R 酶 L-19

27、 IVS,酶 分 子 修 饰,氨基酸置换修饰 Amino-acid substitute modification 将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶催化特性的修饰方法 肽链上某个氨基酸的改变会引起酶化学结构和空间构象的改变 氨基酸置换修饰的作用 提高酶的催化效率（例：酪氨酸-RNA 合成酶 Thr51 Pro51，对ATP 亲和力提高近 100 倍，催化效率提高 25 倍） 增强酶的稳定性（例：T4 溶菌酶 Ile3 Cys3，与 Cys97 形成二硫键，热稳定性提高） 改变酶的专一性（例：农杆菌 -葡萄糖苷酶 Glu358 Ala358，失去水解活性，却能催化糖苷合

28、成）,酶 分 子 修 饰,氨基酸置换修饰 置换修饰方法 化学修饰 对某些侧链结构相近的氨基酸残基进行基团修饰，从而变成另一种氨基酸残基 难度较大，很难精确操作,酶 分 子 修 饰,氨基酸置换修饰 置换修饰方法 定点突变 在 DNA 序列中的某一特定位点上进行碱基的改变 蛋白质工程常用的技术手段 1983年，美国生物学家 Ulmer 首先提出了“蛋白质工程”的概念 蛋白质工程通过改造蛋白质相对应基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到宿主细胞中，通过基因表达而获得具有新特性的蛋白质的技术过程 蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有诸多同基因工程技术相似的地方，因此蛋白

29、质工程也被称为第二代基因工程,酶 分 子 修 饰,氨基酸置换修饰 定点突变主要步骤 1) 新的分子结构设计 根据已知蛋白酶的化学结构、空间结构及其特性，确定新蛋白质或酶的氨基酸排列顺序，乃至欲置换的核苷酸及其位置 2) 突变基因的核苷酸序列确定,酶 分 子 修 饰,氨基酸置换修饰 定点突变主要步骤 3) 突变基因的获得 用 DNA 合成仪合成有数个核苷酸被置换了的寡核苷酸链，再以此寡核苷酸链为引物，通过 PCR 扩增获得所需的大量突变基因，即寡核苷酸诱导的定位突变 4) 新酶的获得 重组表达 将定位突变获得的突变基因进行体外重组，插入适当的基因载体中，通过基因操作技术转入特定的宿主细胞中，培养

30、并表达所需的修饰酶,酶 分 子 修 饰,氨基酸置换修饰 实验操作大致步骤 1) 先测定酶的一级结构 2) 用 NMR、X 射线衍射法等方法分析测定其三维结构 3) 根据结构信息选择突变部位，即选定哪一个氨基酸残基要被取代 4) 选择 46 个氨基酸残基的寡肽序列，其间含待取代的氨基酸残基 5) 用化学法合成由 1218 个碱基组成并为所选寡肽的氨基酸序列编码的核苷酸序列，作为定位诱变的引物 6) 构建单股质粒，含有为所需蛋白质编码的基因，作为定点突变的模板,酶 分 子 修 饰,氨基酸置换修饰 实验操作大致步骤 7) 将引物与单链模板 DNA 配对，用 PCR 法将引物延长，形成互补链，得到共价

31、闭合的双链DNA，也叫异质双链质粒 8) 将异质双链质粒引入宿主细胞（如 E.coli），转化为两个同质双链质粒，一个含天然蛋白质编码的基因，另一个含编码突变体的基因 9) 将这两个基因分离并克隆，最后产物是细胞转化突变型，能合成突变体蛋白质，与母体蛋白质仅有 1 个氨基酸的差别，这个氨基酸就是事先选定的突变部位,酶 分 子 修 饰,核苷酸置换修饰 Nucleotide substitute modification 将 R 酶分子核苷酸链上的某个（或数个）核苷酸置换成其他的核苷酸，一般采用定位突变技术 自我剪切酶的保守序列和剪切位点序列与酶的催化作用关系密切 对自我剪切酶的结构与功能研究可了

32、解酶催化中心必需基团，据此进行分子改造，从催化分子内反应的 R 酶设计出催化分子间反应的 R 酶,酶 分 子 修 饰,核苷酸置换修饰 核苷酸置换对催化特性的影响 例：L-19 IVS 活性中心碱基变化,酶 分 子 修 饰,核苷酸置换修饰 Nucleotide substitute modification 例：锤头型核酶（hammer head ribozyme）,1989年，Koizumi 证明只要保留11个核苷酸保守序列即可催化自我剪切反应。,酶 分 子 修 饰,核苷酸置换修饰 锤头型核酶的置换修饰 除了 11 个保守核苷酸以外的其他核苷酸都可以置换修饰,酶 分 子 修 饰,核苷酸置换修饰

33、 发夹型核酶（hairpin ribozyme）的置换修饰 1989年，Hamp 提出烟草环斑病毒（sTRSV）负链 RNA 自我剪切反应是基于发夹结构（一种回文结构），只要形成此结构就会在底物识别序列处自动催化剪切反应,酶 分 子 修 饰,酶分子的物理修饰 Physical modification 通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法 研究极端条件下酶结构和活性的变化 “极端微生物” 物理修饰的特点 不改变酶的组成单位及其基团 酶分子中的共价键不发生改变 酶的一级结构不变 副键发生某些改变和重排 酶的高级结构发生变化,酶 分 子 修 饰,酶分子

34、的物理修饰 物理修饰的效果 改变底物特异性 例：羧肽酶 经高压处理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反应（逆反应） 改变酶催化的最适温度 例：纤维素酶经高压处理，最适温度下降，但在 3040 oC 条件下，活力提高了 10% 提高酶的稳定性 例：用盐酸胍破坏胰蛋白酶的空间构象，伸展肽链，再透析除去盐酸胍，在不同温度下重新构建 / 恢复酶的构象，50 oC 下重新构建的酶稳定性比天然酶提高 5 倍,酶 分 子 修 饰,酶的定向进化修饰 Enzyme directed evolution 模拟自然进化（随机突变和自然选择）的过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件

35、的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体 定向进化的三个过程 随机突变：产生基因多态性 构建突变基因文库：将突变基因与适当的载体重组 定向选择：高通量筛选方法 随机突变的方法 易错 PCR（error-prone PCR） DNA 改组（DNA shuffling）,酶 分 子 修 饰,酶的定向进化修饰 易错 PCR（error-prone PCR） 通常 PCR 使用的 Taq DNA 聚合酶失去了 35 方向的校正活性，因此核苷酸错误掺入的几率约为 510-5 如果配合适当的条件，调整正常 PCR 体系中 dNTPs 的浓度，提高 Mg2+ 浓度，引入 Mn2+ ，可以高频率

36、随机引入错配的突变位点，构建突变文库，再筛选突变体 连续多次反复地随机诱变，通过每一步的积累产生有益突变,酶 分 子 修 饰,酶的定向进化修饰 DNA 改组（DNA shuffling） 从正突变的基因库（可以通过易错PCR 构建）中分离出 DNA 片段，用脱氧核糖核酸酶 DNaseI 随机切割，得到的随机片段经过不加引物的多次 PCR 循环，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直至获得全长的基因 将亲本基因群中的优势突变尽可能地组合在一起，最终使酶分子的某一性质得到进一步进化,酶 分 子 修 饰,酶的定向进化修饰 突变文库的定向筛选 根据进化的目标设定选择环境条件 例：为提高酶的热稳定性，可

37、以在较高的温度下培养重组细胞，并在每一次“突变筛选”的循环中逐步提高培养温度 高通量筛选 96 孔板（384 孔板）筛选 标记筛选（荧光标记、放射性标记） 噬菌体表面展示技术 酵母细胞表面展示技术 ,酶 分 子 修 饰,酶的定向进化修饰 例：对硝基苄酯酶的定向进化修饰,酶 分 子 修 饰,酶的定向进化修饰 例：酯酶的定向进化修饰 将 10 g 用 PCR 扩增过的亲本 DNA 片段用 DNaseI 切割，在Pwo DNA 聚合酶催化下进行第一次 PCR 扩增，35 轮循环后补加 Pwo DNA 聚合酶，再进行 35 轮循环，得到的扩增产物进行第二次 PCR 常规扩增 将扩增产物和 pNB106

38、R 质粒用 BamHI 和 XbaI 酶切，体外连接后转化到 E. coli. TG1 宿主细胞中，获得重组子 在一定浓度 DMF 溶液中对底物 LCN-pNB 的催化活力进行筛选，得到一株高活性进化酶；在 DMF 水溶液中催化水解含 p-硝基苄酯结构的化合物活力可提高 30 倍,酶 分 子 修 饰,修饰酶的特性总结,修饰酶的酶学性质变化,最适pH值,热稳定性,体内抗原性,半衰期,酶动力学性质,对组织的 分布能力变化,酶 分 子 修 饰,修饰酶的特性总结 热稳定性 修饰剂与酶形成多点交联，一般能增强酶的热稳定性，可能的原因是多点交联产生固定酶分子构象的效应 PEG 修饰酶在热稳定性上没有明显提

39、高，可能由于 PEG 和酶是单点交联 酶分子内基团间相互作用在受热情况下发生了变化，向热力学上熵增加的方向变化，即从紧密有序趋于随机松散 通过修饰后，使酶天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，减小热振动，从而增强酶的热稳定性,酶 分 子 修 饰,修饰酶的特性总结 最适 pH 值 一般情况下，修饰酶的最适 pH 范围扩大 猪肝尿酸酶的最适 pH 为10.5，在pH 7.4 的生理环境中酶活仅剩 510%，用白蛋白修饰后，最适 pH 范围扩大，在pH 7.4 时仍保留 60% 酶活 吲哚-3-链烷羟化酶修饰后，最适 pH 从 3.5 增加到 5.5，在 pH 7左右时，修饰酶活力比天然酶增加 3 倍

40、，在生理环境下抗肿瘤效果比天然酶大得多 可能的原因 修饰酶的微环境更稳定 修饰酶被“固定”在一个更活泼的状态,酶 分 子 修 饰,修饰酶的特性总结 半衰期 酶经修饰增强了抗蛋白水解、抗抑制剂和抗失活因子的能力及对热稳定性提高，半衰期一般都比天然酶延长 体内抗原性 有些修饰剂在消除酶抗原性上并无作用，如 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）修饰酶；糖类物质也不容易消除酶的抗原性 现在比较公认的是 PEG 和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果明显，原因可能是修饰剂破坏（共价结合）或“遮盖”了抗原决定簇，使之抗原性减弱或消除,酶 分 子 修 饰,修饰酶的特性总结 酶动力学性质 绝大多数酶经修饰后最大反应速度 Vmax 没有变化 有些酶在修饰后，米氏常数 Km 通常会增大，这可能是交联于酶上的大分子所产生的空间障碍影响了底物对酶的接近和结合 修饰酶抵抗各种失活因子的能力增强和体内半衰期的延长，能够弥补 Km 增大的缺陷,酶 分 子 修 饰,修饰酶的特性总结 对组织的分布能力变化 某些酶经化学修饰后，对组织的分布能力有所改变，能在血液中被一些器官选择性地吸收 例1：-葡萄糖苷酶 Pompe 病（糖原贮积 II 型）主要是由于糖原贮积于肝细胞的二级溶酶体造成的，用 -葡萄糖苷酶治疗时希望酶能尽快到达肝细胞处，