医械生物学评价实验.ppt

1、医疗器械生物学评价试验介绍,山东省医疗器械产品质量检验中心 生物学评价室王昕2017年10月,医疗器械生物学评价相关规章,国家食品药品监督管理总局2014年第43号 关于公布医疗器械注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告,医疗器械生物相容性评价研究,应对成品中与患者和使用者直接或间接接触的材料的生物相容性进行评价。,生物相容性评价研究资料应当包括：,1.生物相容性评价的依据和方法。 2.产品所用材料的描述及与人体接触的性质。 3.实施或豁免生物学试验的理由和论证。 4.对于现有数据或试验结果的评价。,医疗器械生物学评价系列标准,GB/T16886.1-20部分 GB/T16886.1风险管理

2、过程中的评价与试验,5,GB/T 16886 医疗器械生物学评价 系列标准,GB/T 16886 医疗器械生物学评价 系列标准,GB/T16886.18材料化学表征 GB/T16886.19材料物理化学形态学和表面特性表征 GB/T16886.20医疗器械免疫毒理学试验原则和方法,8,依据GB/T16886/ISO10993系列标准基本原则制定了两项医疗器械生物学试验方法的国家标准： GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法 GB/T16175-2010医用有机硅材料生物学评价试验方法,1.基本评价试验,细胞毒性-GB/T16886.5 刺激或

3、皮内反应（皮肤、 皮内、眼、口腔、阴道、直肠、阴茎）-GB/T16886.10 致敏-GB/T16886.10 血液相容性（血栓、凝血、血小板、溶血、补体、血液学）-GB/T16886.4 植入试验（皮下、肌肉、骨）-GB/T16886.6 全身毒性（急性全身毒性、重复接触全身毒性）-GB/T16886.11 遗传毒性(AEMS、染色体畸变试验、小鼠淋巴瘤）-GB/T16886.3,2.补充评价试验,（1）慢性毒性口、吸入、经皮、静脉、腹膜、植入途径。 （2）致癌性。 （3）生殖和发育毒性。 （4）生物降解聚合物、金属、合金、陶瓷。,医疗器械生物学试验样品制备,参考标准：GB/T16886.1

4、2-2005（ISO10993-12:2002) 试验样品的选择和制备标准化是保证生物学评价试验结果可靠性和可比性的很关键的一步。 在进行试验以及解释试验结果时，应考虑器械在人体应用时的接触性质、程度、频率、时间和条件等因素，其中最关键的因素之一就是试验样品的制备。 当制备器械浸提液时，所用的浸提介质和浸提条件应该既与最终产品的性质和用途相适应，又要与试验方法的可预见性（如试验目的、原理、敏感性等）相适应。因此理想的浸提条件和试验系统浸提液的应用既要反映产品的实际使用条件，还要反映试验的目的和预测性。,医疗器械生物学试验样品的选择,1. 应采用最终产品、最终产品中有代表性的样品或与最终产品相同

5、的工艺过程制得的材料以及它们的浸提液进行试验。选择的样品必须被证明合理。 2. 处置试验样品与参照样品时应谨防污染。来自制造过程的任何残留物应视为器械、器械部件或组件的构成部分。 （1） 试验样品如取自非无菌状态，但要求使用前灭菌的器械，试验样品应按照制造厂家推荐的灭菌方法灭菌，必要时，试验应采取无菌操作。 （2）如果试验样品在灭菌前清洗，应考虑清洗过程和清洗剂对试验样品选择和处置方面的影响。 3如果试验过程要求无菌试验样品，应考虑灭菌或再灭菌过程对试验样品和参照材料的影响。 4当试验样品和参照材料需要分割成小片时，应考虑原先没有暴露的表面（如腔或切面）的影响。,医疗器械生物学试验样品的选择,

6、6. 从器械选择有代表性的部分 （1）如器械不能以整体用于试验时，应选取最终产品中各种材料有代表性的部分按比例组合成试验样品。 （2）有表面涂层器械的试验样品应包括涂层材料和基质材料，即使基质材料没有和组织接触。 （3）与病人接触的器械部件在制造过程中如使用了粘结剂、射频密封或溶剂密封，试验样品则应包括粘接和/或密封处有代表性的部分。 （4）复合材料应作为最终材料进行试验。 （5）当一个器械由不同的材料组成，在选择试验样品时，应考虑其潜在的协同作用和相互作用。 （6）选择的试验样品应能使器械组件最大限度地与试验系统接触，以了解潜在的生物学。,浸提条件和方法,浸提温度 浸提时间 浸提比例 浸提介

7、质,浸提温度和浸提时间,可采用下列的一个条件进行浸提： (371)，（722）h； (502)，（722）h； (702)，（242）h； (1212)，（10.1）h；,注：,在多数情况下为产品使用适宜的加严条件。 对于细胞毒性试验，含血清的细胞培养介质可在(371)，（242）h条件下浸提。 采用高温浸提时应注意： 可能会导致聚合物的交联和/或聚合作用增强； 可能会引起材料明显出现降解。 可降解材料浸提时要用适当的介质、时间、温度条件来模拟尽可能的过度暴露。完全的溶解是适当的。,标准表面积和浸提液体积,注：,标准的表面积包括样品两面和连接处的面积，不包括不确定表面的不规则面积。当由于样品外

8、形不能确定其表面积时，浸提时可使用质量/体积。 浸提之前应将材料切成小块，以使材料浸没在浸提介质中。 由于完整表面与切割表面存在潜在的浸提差异，因此对于弹性体、涂层材料、复合材料、层状薄片等应尽量采用完整的样品进行试验。,浸提介质,浸提介质示例： 极性介质：水、生理盐水、无血清培养皿； 非极性介质：各国药典中规定的新鲜精制植物油（如棉籽油或芝麻油）； 其余介质：乙醇/水、乙醇/生理盐水、聚乙二醇400（稀释至生理渗透压）、二甲基亚砜和含血清培养基。,浸提液制备的注意事项,浸提应在搅拌的条件下进行。当认为静态适宜时，应对试验方法加以论证、规定并出具报告。 如可能, 液体浸提液应在制备后立即使用,

9、 以防止吸附在浸提容器上或成分发生其他变化。 不应调整浸提液的ph值除非给出理由。 浸提液一般不应采用过滤、离心或其他方法来去除悬浮的粒子，如果必须进行时，应说明其理由。,浸提液制备的注意事项,对于在使用条件下不是可溶解和再吸收的材料和器械，进行浸提的任何溶剂不应导致聚合物发生分解。聚合材料在挥发性溶剂中只应发生轻微变软（如小于10%的溶解度）。 如果器械是不能浸提的水状液体，可用液体直接进行试验。 在正规使用条件下液体是在器械内循环，可以采用循环方式进行浸提，尽可能加大一个或多个实验条件，如温度、时间、体积、流速。选择这种浸提方式的基本原理应该在报告中注明。,细胞毒性试验,细胞毒性试验,现有

10、版本是GB/T16886.5-2005（ISO10993-1999），GB/T16886.5-20 xx（ISO10993-2009）正在报批中。 敏感性高、重现性好，结果有一定的临床相关性，因此被广泛地应用于医疗器械生物学评价中，特别是作为新材料筛选时的必做试验。国内外无论哪项医疗器械生物学评价标准中都把细胞毒性试验列为首位，作为首选项目。,概述,定义：该试验采用已建立的细胞系（ATCC CCL1(NCTC clone 929)）, 测定由器械、材料和/或其浸提液造成的细胞溶解(细胞死亡)、以及对细胞生长的抑制和其他影响。 意义：该试验属体外试验，能在短期内检出供试品对细胞新陈代谢功能的影响

11、，对毒性物质具有较高的敏感性，从而能快速筛选材料。因此，细胞毒性试验为生物学试验中首选试验项目。,（一）评价类型简介,医疗器械的细胞毒性可以有以下二种评价类型： 1. 按不同生物学终点评价 (1) 细胞形态学评价：定性检测方法，结果评价相对比较初浅，通常仅作为一种辅助或补充的方法。 (2) 细胞膜效应评价：中性红染色法，台盼兰染色法，荧光素染色法等。 (3) 细胞生长能力评价：细胞增殖度测定。 (4) 细胞代谢特性评价：法、各种测定细胞总蛋白量，蛋白质合成率和酶活性的方法。,2. 按不同接触方式评价 (1) 浸提液方式：将供试品浸在介质介质中，经过一定的时间和温度的作用，取其浸提液与培养的细胞

12、接触。 (2) 直接接触方式：将供试品直接与培养的细胞接触。 (3) 间接接触方式：将细胞与供试品隔开，在该体系中上层的供试品可以通过中间介质中的孔隙影响下层的细胞。包括琼脂扩散试验、滤膜扩散试验。,常用的细胞毒性试验,MTT （四唑盐）法：哺乳动物细胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。 该试验用于细胞毒性定量评价。 对该试验有干扰的供试品不适于本试验。,浸提方法,常用浸提方法举例：按照4g/20ml浸提介质的比例，浸提介质为含血清的细胞培养基，（371），（242）h。 注意：浸提液接触细

13、胞之前，如果进行过滤、离心等处理，应详细记录并对这些步骤加以说明。宜避免对浸提液进行处理，例如对pH值的调整，因为这会影响到试验结果。,细胞毒性结果分析,定性评价：分级达到2级以上时被认为有细胞毒性效应。 定量评价： 细胞活性下降大于 30%被认为有细胞毒性反应。,细胞毒性结果评价,细胞毒性仅仅是一种最初的信号，它预示存在体内毒性的可能性，事实上单凭细胞毒性数据还未必能确定该器械一定不适用于特定的临床应用 在对细胞毒性的结果评价时需要结合其他生物相容性数据和产品的预期用途进行综合评价。 在解释试验数据时还必须考虑到该试验系统的局限性。,刺激试验,刺激是不涉及免疫学机制的一次、多次或持续与试验材

14、料接触所引起的局部炎症反应。 要测定器械、材料及其潜在可溶出物的刺激作用，试验的进行应与使用或接触的途径和持续时间相适应。 刺激试验具有较高的敏感性，是医疗器械三项基本生物学评价项目之一。,刺激试验类型,皮肤刺激 皮内反应 特殊的刺激试验：眼、口腔、阴茎、直肠和阴道刺激等,注：,任何显示为皮肤刺激物或pH2.0或11.5的材料也不宜再进行试验，宜标示为潜在的眼刺激物。 任何已显示为皮肤或眼的刺激物，或pH2.0或11.5的材料不应再进行试验，可标示为潜在的口腔、阴茎、直肠、阴道组织组织刺激物。 任何显示为皮肤、眼、黏膜组织刺激物的材料，或是pH2.0或11.5的材料，不应进行皮内试验。,皮 内

15、 反 应,试验结果评价,对一些广泛应用于人体正常或损伤皮肤的产品,一般不允许对皮肤有实质性危害存在。 在某些情况下，阳性试验剂量不一定就判定材料不能使用。,致敏试验,定义：免疫介导的对某种物质的皮肤反应。 该试验属体内试验，方法学相对比较成熟，灵敏性较高，因此为各类医疗器械必须评价的项目之一。,方法,最大剂量法 封闭斑贴法 小鼠局部淋巴结试验（LLNA）,试验结果评价,按本标准试验步骤得出的试验结果不能单独成立。 阴性试验结果往往不能排除产品可能导致皮肤过敏反应的可能性。 出现阳性试验结果有时不一定就表明器械或材料不能使用。,全身毒性试验,急性全身毒性 亚急性全身毒性 亚慢性全身毒性 慢性毒性

16、 热原反应,重复接触全身毒性试验,定义,急性全身毒性：在24h内一次、多次或持续接触试验样品后在任何时间发生的不良作用。注：与药典上的异常毒性试验不同。 亚急性全身毒性：在24h28d内多次或持续接触试验样品后发生的不良作用。 亚慢性全身毒性：反复或持续接触试验样品后在动物寿命期的某一阶段发生的不良作用。 慢性全身毒性：在动物的主要寿命期内反复或持续接触试验样品后发生的不良作用。,重复接触全身毒性试验,接触途径 接触剂量 接触时间,接触途径,GB/T 16886.11-2011中规定，医疗器械或其可沥滤物可通过多种接触途径进入人体，亚慢性（亚急性）全身毒性试验最好采用具有临床相关性的接触途径，

17、如采用其他接触途径应予以论证。 接触方式有皮肤、植入、吸入、皮内、肌内、腹腔、静脉、经口、皮下等。,接触剂量,对于较长期试验，宜包括至少三种剂量水平和适当的对照组。 采用一种适宜的试验样品剂量进行单剂量组试验可判定是否存在毒性危害（即限度试验），但其他多剂量或剂量反应试验要求多个剂量组来判定毒性反应。 如准备采用加严剂量，可增加剂量组。,剂量频率：应具有临床相关性。在重复接触试验中，试验周期内动物最好每周7日接触试验样品。 剂量体积：GB/T 16886.11-2011中附录B规定试验样品接触最大剂量体积，但不应做为常规接触剂量的选择。,结果评价,观察项目：体重变化、临床观察、临床病理学、大体

18、病理学、器官称重、组织病理学等。 综合分析各指标，判定是否具有“生物学相关性”。 应注意此类试验的局限性，对结果进行科学的判断。,热原试验,致热性是某种化学制剂或其他能产生发热反应物质的一种特性。本部分所涉及的是材料介导的致热性。 常用方法是将材料浸提液由静脉注入兔内，在一定时间内观察兔体温变化，以判断在材料或浸提液中所含热原量是否符合人体应用要求。 只做该项试验尚不能区分热原反应是因材料本身还是因内毒素污染所致。只有同细菌内毒性试验相结合才能做出热原反应是否是因材料致热性所致。,内毒素介导的致热性 这种致热形式源自于革兰氏阴性细菌的生物活性内毒素，通常为医疗器械制造过程中的诱导发热的污染物，

19、可采用特异性细菌内毒素试验（鲎试剂法）测定器械内毒素含量来进行评价。 材料介导的致热性 该类型致热性为非内毒素相关因素引起，,一般认为，热原试验主要适用于与循环血液接触的器械。 ASTM规定，与中枢神经系统和胸腔接触的器械也要进行热原试验。 注：热原试验是静脉注射，需要考虑浸提液的状态。,遗传毒性,试验目的：使用哺乳动物或非哺乳动物细胞培养或其他技术来测定由医疗器械、材料和(或)其浸提液引起的基因突变、染色体结构和数量的改变，以及其他DNA或基因毒性。,遗传毒性,实验策略：优先体外试验，方案1：细菌基因突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验、哺乳动物细胞诱导性试验.方案2：细菌基因突变试验、哺乳动

20、物细胞基因突变试验（覆盖诱裂性和基因突变）。,遗传毒性,实验策略：如果体外试验出现阳性，应进行体内诱变性试验。常用体内试验包括啮齿动物微核试验、啮齿动物骨髓中期分析、哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验。,血液相容性,试验目的：血液相容性试验用一个相应的模型或系统评价与血液接触的医疗器械或材料对血液或血液成分的作用。,血液相容性,试验方法：血栓形成、凝血、血小板、血液学（溶血、白细胞计数、白细胞活化、网织红细胞计数）、补体系统,血液相容性,溶血试验： 供试品的溶血率应小于5% 。 血,生殖毒性试验,试验目的：评价试验样品对生殖功能、胚胎发育（致畸性）以及胎儿和早期婴儿发育潜在影响。,生殖毒性试验

21、,可能需要进行生殖及发育毒性试验的材料或器械： 1. 与生殖组织或胚胎（胎儿）直接长期或永久接触的器械。 2. 储能医疗器械。 3. 可吸收材料或可溶出物质。（如在吸收、代谢和分布研究方面有充分可靠的数据，或者材料或医疗器械浸提液中鉴别出的所有成分均无生殖和发育毒性时，就无需进行试验。,重点试验,60,内 容,植入后局部反应试验,2,细胞毒性的定义,根据欧洲标准化组织CEN1992年30号文件的定义,细胞毒性是指由产品、材料及其浸提物所造成的细胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制。 ISO10993.5-2009的定义： Cytotoxicity is an irreversible damage

22、to living cells. 对活细胞不可逆的损害。,细胞毒性试验是运用哺乳动物细胞体外培养技术，检测医疗器械/材料引起的细胞生长抑制，溶解死亡等毒性作用。,体外细胞毒性试验的特点,对毒物高度敏感。 试验周期短，可用于快速筛选。 试验方法标准化，试验结果重复性好，便于实验室之间的结果比对。,体外细胞毒性试验具有通用性, 广泛适用于各种医疗器械和材料的评价。,ISO10993.5-2009,ISO 10993-5:2009和GB/T16886.5-2003(ISO 10993-5:1999)的区别,新标准修订内容如下： 修改了“材料浸提液的制备”、“试验步骤”“结果评价”等相关内容，给出了细

23、胞毒性定性和定量评价指标； 增加了“附录A中性红摄取(NRU)细胞毒性试验”； 增加了“附录B 集落形成细胞毒性试验”； 增加了“附录C MTT细胞毒性试验”； 增加了“附录D XTT细胞毒性试验”。,细胞毒性测定中所使用的大量终点测定方法可分成以下评价类型： 按形态学方法评定细胞损伤； 细胞损伤的测定； 细胞生长的测定； 细胞代谢特性的测定。,ISO10993-5:2009术语和定义,近汇合 subconfluency 在对数生长期末，约80%的细胞融合。 空白 blank 不含试验样品的浸提介质，浸提期间置于与试验样品相同的器皿中，并经受与试验样品相同的条件。,浸提液试验,浸提液试验结果的

24、重现性稳定。 样品与其他类似器械或材料的结果在实验 室内部和各实验室间的水平上具有可比性。 浸提液试验被普遍认可。,a) 含血清培养基; b) 生理盐水溶液; c) 其他适宜的介质。 含血清培养基是首选的浸提介质，优先选用含血清培养基用于浸提是由于其具有支持细胞生长以及浸提极性和非极性两种物质的能力。 除了含血清培养基，在明确要浸提极性物质（例如离子化合物）时宜考虑采用无血清培养基。其他适宜的介质包括水和二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中, DMSO如高于0.5（体积分数）时有细胞毒性。与含血清培养基浸提法相比，由于DMSO浸提液稀释度较大，溶出物的细胞接触浓度会比较低。,浸提介质,

25、含血清培养基按照a) （371）规定的浸提条件，因为浸提温度超过（371）会对血清化学和/或血清稳定性以及培养基中其他成分产生不良影响。 浸提液接触细胞之前，如果进行过滤、离心或用其他方法处置，最终报告中对此应详细记录并对这些步骤加以说明，对浸提液pH值的调整也应在报告中说明。宜避免对浸提液进行处理，例如对pH值的调整，因为这会影响到试验结果。,浸提条件,细胞系,优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取。 若贮存某一原种培养细胞系时, 则应将其放在相应培养基内, 在80或80以下冻存，培养基内加有低温防护剂, 如二甲基亚砜或甘油。长期贮存（数月至数年）只能在130或130以下冻存。,培养基,

26、培养基应无菌。 含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。 培养基中可含有对试验无不良作用的抗生素。,原种培养细胞制备,用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。使用存储细胞时, 如加有低温防护剂要除去, 使用前至少传代培养一次。 传代培养细胞时, 采用适合细胞系的酶分散法和/或机械分散法。,试验步骤,平行样数 应至少采用三个平行试验样品数和对照品数。 浸提液试验 本试验用于细胞毒性定性和定量评定。 试验宜在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。 试验开始前用显微镜验证培养细胞的近汇合和形态学情况。 经过至少24h的培养后，确定细胞毒性反应。,细胞毒性的测定,可采用定性或定量方法测定细胞毒

27、性反应。 定性评价: 用显微镜检查细胞，必要时采用细胞化学染色，评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、 细胞溶解和胞膜完整性等方面的改变。在试验报告中应描述性地或以数字记录正常形态的变化，表1给出了用于对试验样品分级的方法。,表1 浸提液细胞毒性形态学定性分级,正常开始,正常中间,正常结束,正常细胞,给毒后的细胞形态：,阴性对照,空白对照,阳性对照,四级结果,浸提液试验的定量评价,定量评价: 测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞增殖或克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放、活体染料的还原或其他可测定的参数进行定量测试。试验报告中应记录使用的方法和反应。 ISO1099

28、3-5：2009规定细胞活性下降大于 30%被认为有细胞毒性反应。,ISO10993-5 ：2009附录C（资料性附录） MTT 细胞毒性试验,原理 通过细胞代谢活性测定细胞的存活率。 MTT黄色水溶液 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)在活细胞内代谢性减少，生成蓝紫色不可溶的甲瓒。甲瓒溶于异丙醇后用分光光度计测定的色度与活细胞数目相关。,试验步骤,基本步骤 L929细胞接种至96孔板，维持培养24h（1倍周期），至形成半汇合单层。然后与系列浓度试验化合物接触。接触24h后测定每一试验浓度甲瓒形成，与对照培养

29、细胞的甲瓒形成进行比较。计算每一试验浓度生长抑制百分比。,材料,试验用细胞系 采用L929细胞(NCTC clone 929: CCL 1, American Type Culture Collection ATCC, Manassas, VA, USA; ECACC No. 88102702, European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)，试验用细胞应无支原体感染。,试验质量检查（）:阳性对照(PC)和阴性对照(NC),试验质量检查（）：空白,未经处理空白的光密度（OD570）绝对值可表明，在试

30、验的两天内以每孔1104接种的细胞是否以正常的倍增时间以指数方式增长。 空白OD570平均值如0.2，则试验符合接受标准。 为了检查细胞接种系统误差，将空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）两侧。 左、右两列空白平均值与全部空白平均值相差如不大于15%，则试验符合接受标准。 对于细胞接种误差的检查，也可以通过相差显微镜检查每块板，以确保细胞数量一致。采用显微镜评价则可免除两列空白的操作。,MTT细胞毒性试验操作流程,数据记录,试验样品（100%浸提液）组试验细胞存活率下降至如空白组试验细胞存活率的70%，则具有潜在的细胞毒性。,ISO10993-5：2009附录D（资料性附录） XTT

31、细胞毒性试验,原理 通过线粒体脱氢酶的测定反应细胞的存活率。 XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl -2H-tetrazolium hydroxide)与线粒体脱氢酶反应，生成水溶性甲瓒。用分光光度计测定的色度与活细胞数目相关。,细胞系 采用L929细胞(NCTC clone 929: CCL 1, American Type Culture Collection ATCC, Manassas, VA, USA; ECACC No. 88102702, European Collection

32、of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)，细胞培养物应无支原体。,试验质量检查（）:阳性对照(PC)和阴性对照(NC),每项细胞毒性试验都包括阳性对照和阴性对照。,试验质量检查（）：空白,未经处理空白的光密度（OD450）绝对值可表明，在试验的两天内以每孔1104接种的细胞是否以正常的倍增时间以指数方式增长。 空白OD450平均值如0.2，则试验符合接受标准。 为了检查细胞接种系统误差，将空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）两侧. 左、右两列空白平均值与全部空白平均值相差如不大于15%，则试验符合接受标准。 对于细胞接种误

33、差的检查，也可以通过相差显微镜检查每块板，以确保细胞数量一致。采用显微镜评价则可免除两列空白的操作。,XTT细胞毒性试验操作流程,数据分析,活细胞数减少是由于样品中线粒体脱氢酶总活性降低，这直接与生成的橙色甲瓒量有关，在450nm测量光密度。与空白比较计算存活率下降情况。,数据记录,试验样品（100%浸提液）组试验细胞存活率下降至如空白组试验细胞存活率的70%，则具有潜在的细胞毒性。,ISO10993.5-2009附录A（资料性附录）中性红摄取(NRU)细胞毒性试验,概述 将BALB/c 3T3细胞接种至96孔平板内并维持培养24h（1倍周期），至形成半汇合单层。然后与系列浓度的试验混合物接触

34、，24h后测定每一试验浓度的NRU并与对照培养细胞测定进行比较。,BALB/c 3T3细胞、clone 31（如ECACC86110401，European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK；CCL-163，American Type Culture Collection ATCC, Manassas, VA, USA) 和从CCL-163ATCC制备的JCRB 9005（Human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan）。,细胞系,试验质量检查（）:

35、阳性对照(PC),细胞毒性试验应包括阳性对照。 多数化学物有历史资料或实验室内、实验室间重复试验的支持，十二烷基硫酸钠（SLS,CAS # 151-21-3）即是最经常用于试验的一种化学物，因此推荐作为阳性对照。在使用SLS时推荐四个浓度标度：0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL。 SLS的IC50历史平均值(Spielmann et. al., 1991 10)为0.093mg/mL。 95%置信区间为0.070mg/mL至0.116mg/mL SLS的IC50如在95%置信区间，则试验符合标准。 推荐使用阳性参照材料和阴性参照材料,试验质量检查（）：空

36、白,未经处理空白的光密度（OD540）绝对值可表明，在试验的两天内以每孔1104接种的细胞是否以正常的倍增时间以指数方式增长。 空白OD540平均值如0.3，则试验符合接受标准。 为了检查细胞接种系统误差，将空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）两侧。 左、右两列空白平均值与全部空白平均值相差如不大于15%，则试验符合接受标准。 对于细胞接种误差的检查，也可以通过相差显微镜检查每块板，以确保细胞数量一致。采用显微镜评价则可免除两列空白的操作。,试验质量检查（）：浓度-反应质量检查,由浓度-反应得出的IC50宜至少有两个或三个（NRU抑制率在10%和90%之间的反应作为支撑。否则，浓度稀

37、释因子可能易于降低，放弃该试验并采用较小的稀释因子重复试验。,3T3NRU细胞毒性试验操作流程,样品浸提液最高浓度（100%浸提液）的细胞相对活性如对照组的70%，材料应被认为无细胞毒性。 浸提液如显示细胞毒性反应，计算每一试验浓度（即试验化学物浓度）的生长抑制率。从浓度反应计算IC50（即产生50%NRU还原的浓度），以浸提液稀释百分比表示。浸提原液为100%浸提液。,数据分析,ISO10993-5：2009附录B（资料性附录）集落形成细胞毒性试验,试验概述 将V79细胞加到6孔板中，保持培养24h至开始对数生长阶段。然后与系列浓度的试验物接触，孵育6天，于集落较大时计数。用甲醇固定集落，吉

38、姆萨液染色并计数。,细胞系,V79细胞（JCRB 0603, Human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan；或美国和欧洲细胞库的其他细胞） 注：推荐使用V79细胞，因为其能形成大并清晰的集落。,试验质量检查（）:阳性对照(PC)阴性材料 (NC),细胞毒性试验应包括阳性对照和阴性对照。如ZDEC和ZDBC。 ZDEC的IC50宜不超过7%。 ZDBC的IC50宜不超过80%。,试验质量检查（）：空白,空白集落平均数如至少为细胞板每孔细胞数目的70%，则试验符合接受标准。,试验质量检查（）：浓度-反应质量检查,由浓度-反应得出的IC50宜

39、至少有两个或三个对照抑制率在10%和90%之间的反应作为支撑。否则，浓度稀释因子可能易于降低，放弃该试验并采用较小的稀释因子重复试验。,试验步骤,注意：原种细胞解冻后，细胞在用于试验之前要传代23次。 第1天 用MEM05培养基制备33.3个细胞/mL的细胞悬液。6孔板的每孔加入3mL细胞悬液。 第2天 孵育24h后从每孔中吸出培养基。加入2mL用MEM05培养基制备的100%浸提液或稀释浸提液。每一浓度平行制备3孔。置培养箱再孵育6天。 第8天 从每孔中吸出培养基，用PBS冲洗每一孔，加入甲醇固定集落，再用5%吉姆萨液染色。计算每一孔集落数目。,结果表示,集落形成细胞毒性试验平板效率如对照组

40、的70%，材料应被认为无细胞毒性。 浸提液如对细胞显示细胞毒性作用，计算IC50(浓度抑制率至50%)，以浸提液百分比表示。 注：平板效率：对照组集落数目除以浸提液组集落数目，以百分数表示系数。,直接接触试验,本试验用于细胞毒性定性和定量评价。 在每只器皿中央部位的细胞层上各小心地放置一个试验样品的试样, 确保试样覆盖细胞层表面约十分之一。 适当的培养周期（最少24h ）。 按表2确定细胞毒性反应。,间接接触试验-琼脂扩散试验,本试验用于细胞毒性定性评价。 不适用于不能通过琼脂层扩散或可能与琼脂相互作用的可沥滤物。 将试验样品的试样小心地放在每只器皿的固化琼脂层上, 确保试样覆盖细胞层表面约十

41、分之一。 适当的培养周期（培养24h72h）。 按表2确定细胞毒性反应。,间接接触试验-滤膜扩散试验,本试验用于细胞毒性定性评价。 孔径0.45m、无表面活性剂的滤膜 。 将试验样品的试样小心地放到滤膜无细胞面的上面。滤膜上放置不产生反应的环, 用以保留浸提液和新加入的混合物。 适当的培养周期（培养2h10min ）。 按表2确定细胞毒性反应。,表2琼脂和滤膜扩散试验及直接接触试验反应分级,植入后局部反应试验,ISO 10993-6:2007和GB/T16886.6-1997（ISO 10993-6:1994）的区别： 新标准修订内容如下： 修改了“范围”， 适用范围增加可降解和/或可吸收性材

42、料； 修改了“植入试验方法通则”、“评价和试验报告”、“肌肉植入中植入样品的数量”等相关内容； 增加了“试验方法的基本方面”； 增加了“附录A 可降解/可吸收性材料植入周期和组织反应的基本考虑”； 增加了“附录E 植入后局部生物学反应评价举例”。,概述,植入后局部反应试验是把医疗器械材料植入实验动物肌肉，皮下组织，骨组织中，在一定周期后，通过肉眼观察和显微技术评价植入部位和周围组织反应情况，样品对活体组织的局部毒性作用。,可能需要进行植入试验的样品,（一）组织反应的基本过程,1 炎症期：以炎症细胞渗出和浸润为主， （1）早期主要以中性粒细胞和淋巴细胞为主； （2）后期出现以淋巴细胞、单核细胞（

43、巨噬细胞）、浆细胞为主的反应-细胞成分可因材料的不同而不同。一般2-4周炎症反应最强，以后逐渐减弱，3个月后炎症反应应基本消失。 例如： 纤维蛋白胶：浆细胞和嗜酸粒细胞； 胶原蛋白材料：淋巴细胞和异物细胞；,2 纤维组织化期： 在炎症期的炎症反应外侧出现纤维母细胞为主的肉芽组织，随着炎症反应的消退，以及纤维细胞增生和分泌胶原纤维，纤维细胞逐渐减少，最终被纤维组织形成的包囊包裹。,（二）植入部位,试验样品应植入与材料临床应用最相关的组织 ： 1）肌肉植入 2）皮下植入 3）骨植入 4）特殊部位植入,植入方式,肌肉植入 皮下组织植入 骨植入,肌肉植入,皮下植入,骨植入,肌肉植入试验,把一定大小形状

44、的试验样品植入实验动物的肌肉组织，同样植入标准对照材料，对照材料是 已确立临床可接收性和生物相容性良好的同类样品材料。定期采集标本和周围组织，肉眼和显微镜下比较观察试验样品和对照材料引起的组织生物学反应。,皮下组织植入试验,用于评定皮下组织对植入材料的生物学反应。对试验样品植入物与对照样品植入物的生物学反应进行比较，对照材料是已确立临床可接受性和生物相容性的医疗器械所采用的材料。,骨植入试验,把植入物插入实验动物的骨组织内，对试验样品植入物与对照样品植入物的生物学反应进行比较，对照材料是 已确立临床可接收性和生物相容性良好的同类样品材料。,实验动物,实验用兔被普遍选用。 对于短期试验，通常使用

45、啮齿动物或家兔。对于长期试验，啮齿动物、家兔、犬、绵羊、山羊、猪及其他平均寿命相对较长的动物比较适宜。,（三）样品制备,应根据最终产品预期所用方法对每个植入样品进行制造、处理、污染物的清洗和灭菌，并应在研究文件中进行确认。,皮下植入样品制备,样品状态 a) 薄片材料应制成直径10mm12mm、厚度0.3mm1.0mm的试验样品。 b) 块状材料应制成直径1.5mm、长5mm、两端为圆头的试验样品。 c) 非固体试验样品（包括粉剂）应装入直径1.5mm、长5mm的导管内。 样品数量： 每种材料和每一植入期至少采用3只动物和足够的植入部位，总数达到10个试验样品和10个对照样品。,肌肉植入样品制备

46、,样品状态： 宽1mm3mm、长度约10mm 较大样品：直径10mm、厚度3mm 样品应制成圆形边缘，两端抛光至纯圆半径。 样品数量： 每一植入期至少采用3只动物和足够的植入部位，总数达到10个试验样品和10个对照样品。,骨植入样品制备,样品状态： 家兔：直径2mm、长6mm的圆柱体 样品数量： 每一植入期应评价至少10个试验样品和10个对照样品。,（四）试验周期,试验周期应根据临床可能接触时间来确定，或是持续至相应生物学反应达到或超过某一稳定状态。选择的时间点应进行说明和论证。 非降解、非吸收性材料： 1）短期反应：1周到4周； 2）长期反应：12周以上。,结论,结论：在本试验下列情况下，试

47、验样品判定为： 无刺激（0.02.9） 轻微刺激（3.08.9） 中度刺激（9.015.0） 重度刺激（15） 与阴性对照样品比较组织反应。,生物降解试验,参考标准：GB/T16886.6 试验周期应与植入部位、植入物的尺寸、估计的降解时间相关。,可降解/可吸收性材料植入周期和组织反应的基本考虑,应对植入物各时间点与降解过程相关的局部组织反应进行评价（不推荐单一的植入时间点）： a)发生降解时； b)中期降解阶段； c)达到稳定状态时，组织恢复或接近完全降解 （一般需要达到或超过吸收终点，即完成预期的重塑和修复的最终组织反应或生物反应恢复至正常组织学）。,刺激与皮肤致敏试验,ISO 10993

48、-10:2010和GB/T16886.10-2005(ISO 10993-10:2002)的区别,新标准修订内容如下： 修改了标准名称； 修改了术语和定义； 取消了原“5.4材料鉴别”； 皮内反应试验由附录B调整到正文中； 人体皮肤刺激试验方法由正文调整到附录C； 皮肤致敏试验增加小鼠局部淋巴结检验法； 增加了附录D体外皮肤刺激试验； 增加了附录E聚合物试验材料浸提液制备方法。,皮肤致敏试验,概念,皮肤致敏 skin sensitization 变应性接触性皮炎。免疫介导的对某种物质的皮肤反应。 是一种免疫应答反应。,目前三种测定化学物潜在皮肤致敏性的动物试验,最大剂量致敏试验(GPMT) 封

49、闭式贴敷试验(Buehler试验) 小鼠局部淋巴结试验（LLNA）,皮肤致敏试验,GPMT,BT,LLNA,皮肤评分,致敏性评价,BrDU,淋巴细胞 分析,皮肤致敏试验,豚鼠最大剂量试验(GPMT)：最敏感的方法 封闭式贴敷试验(Buehler试验)：适用于局部应用产品。 小鼠局部淋巴结试验（LLNA）：豚鼠试验的唯一替代试验，用于检验单一化学物，并且目前为化学物的首选测定法。 注：全部三种方法被开发用于测定化学物的致敏潜能，即接触性皮炎、迟发型（型）超敏反应,最大剂量致敏试验(GPMT),经皮内注射诱导，斑贴激发的方式将试验材料或其浸提液作用于豚鼠，在规定时间内观察豚鼠激发部位皮肤反应，以评

50、价样品是否具有引起迟发性超敏反应的潜能。,最大剂量致敏试验适用范围,适用于评价与人体接触所有类型的产品及其浸提液。,最大剂量致敏试验过程,皮内诱导阶段（试验样品皮下注射）7天后 局部诱导阶段（试验样品敷贴48小时）14天后 激发阶段（试验样品敷贴24小时） 结果观察24小时和48小时。,Magnusson 和Kligman分级,GPMT 阳性试验 （ 0.1%DNCB ）,结果评价,按Magnusson 和Kligman分级标准，对照组动物分级小于1，而试验组中分级大于或等于1时一般提示致敏。如对照组动物分级大于或等于1时，试验组动物反应超过对照组中最严重的反应则认为致敏。,小鼠局部淋巴结试验

51、（LLNA）,在小鼠耳背部局部处置某一试验样品后，测定鼠耳应用部位引流淋巴结内淋巴细胞的增殖程度。指定某种试验材料为致敏物，其临界值是与对照活性比较细胞增殖应答为3倍或更多。,封闭贴敷试验(Buehler试验),采用封闭斑贴诱导，激发方式将试验材料或其浸提液作用于豚鼠，在规定时间内观察豚鼠激发部位皮肤反应，以评价样品是否具有引起迟发性超敏反应的潜能。,封闭贴敷致敏试验适用范围,适用于预测中度至重度致敏物，不能采用最大剂量致敏试验法的样品或接触表皮的样品。,封闭贴敷致敏试验过程,诱导阶段（一周敷贴3次，每次6小时。连续3周） 14天后 激发阶段（试验样品换位敷贴6小时） 结果观察24小时和48小

52、时。,结果评价,同最大剂量致敏试验,刺试激验,定义,刺激 (irritation)：一次、多次或持续与一种物质（材料）接触所引起的局部非特异性炎症反应。 注：皮肤刺激是一种可逆反应，主要以皮肤红斑（发红）为特征。 非免疫应答反应。,分类,皮肤刺激 皮内反应 粘膜刺激 阴道刺激 直肠刺激 阴茎刺激 口腔粘膜刺激 眼刺激,首选试验动物为家兔 口腔粘膜刺激试验动物为金黄地鼠,动物选择,动物皮肤刺激试验,采用相关动物模型对材料在试验条件下产生皮肤刺激反应的潜能做出评定。 模拟样品临床使用 ，将样品或样品浸提液直接贴敷于动物皮肤上，在规定的时间内观察动物皮肤反应，以评价样品是否具有潜在的皮肤刺激作用。,

53、动物皮肤刺激试验适用范围,适用于预期与人体正常或损伤皮肤接触的医疗器械和材料,动物皮肤刺激试验,试验动物 健康、初成年的白化兔，雌雄不限，同一品系，体重不低于2kg。 使用数量 3 只 如预期有刺激反应，初试应考虑使用1只动物。除非出现明显的阳性反应红斑或水肿记分大于2，否则应至少再使用2只动物进行试验。,试验步骤,动物准备 试验前4h24h将动物背部脊柱两侧被毛除去(约10cm15cm区域) 。 试验样品的应用 粉剂或液体样品 将0.5g或0.5mL的试验材料直接置于皮肤。固体和疏水性材料无需湿化处理，粉剂使用前宜用水或其他适宜的溶剂稍加湿化。 用2.5cm2.5cm非封闭式的敷料(如吸收性纱布块)覆盖接触部位，然后用绷带（半封闭性或封闭性）固定敷贴片至少 4h。接触期结束后取下敷贴片，用持久性墨水对接触部位进行标记。 样品浸提液 将相应的浸提液滴到2.5cm2.5cm大小的吸收性纱布块上，浸提液的用量以能浸透纱布块为宜，一般每块纱布滴0.5mL，按图1所示部位敷贴于动物背部两侧。 用绷带（半封闭性或封闭性）覆盖敷贴部位至少 4h。接触期结束后取下敷贴片，用持久性墨水对接触部位进行标记，并用适当的方法除去残留试验材料。,动物皮肤刺激试验部位,结果评价,单次接触试验按下列规定确定原发性