PCR实验室标本管理生物安全和防污染策略汇总.ppt

1、PCR实验室标本管理、生物安全和防污染策略广西壮族自治区人民医院检验科李友琼,标本采集时间对扩增检测结果的影响,在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。,标本采集部位的准备,标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生 物或其他杂物，但应适度，过度清洁消毒有可 能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位的 准备应由训练有素的人员进行。,标本的类型和采集量,标本的类型：血清（浆）、分泌物、痰、尿和脑脊液等。 标本的采集量：应根据所测病原体而定。一般来说，如果标本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测 对于定量检测来说，对标本的收集要求更为精确。,采集质量的评

2、价,血清（浆）标本：溶血、脂血等； 分泌物、痰：评价评价内容包括细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。 评价方法：包括肉眼观察，显微镜下观察和化学分析等。,采样及运输容器,标本的采集材料如棉签应为一次性使用； 运输容器亦应为密闭的一次性装置； 采集所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。,标本采集中的防污染,采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必须经高温灭菌，以使用可能存在的RNase失活。,标本运送,样本一经采集，则应尽可能快的送至检 测实验室。 样本中如加入适当的稳定剂，如用于 RNA测定加入GITC的血清（浆）样本

3、和 用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在 室温下运送过邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各 种临床样本的运送条件作出相应的规定。,第一节 临床标本的处理和保存,一、血清（浆）标本 1. DNA标本 DNA标本的获取、处理和保存， 可按照一本的血清标本处理程序即可。 2. 保存全血样本用于DNA提取检测，可4下短期保存 如用于RNA检测， 则应在取血后尽快提取RNA。,容器的使用,2.RNA标本处理和保存 对于RNA测定，标本 的 获取、处理和方式对测定结果有决定 性影响。研究表明，用于RNA测定的血浆 标本最好是使用EDTA抗凝（严禁使用肝素， 因其对PCR扩增有几只，且很难在核酸提

4、 取过程中完全去除），抗凝后6小时内分 离血浆保存 ；如使用血清标本，则需尽 快（2小时）分离血清后保存。保存时间 短时（1-2周）可放-20下，较长期时应 在-70下。,二、全血标本 以全血作为 待测标本时,1. 抗凝剂的选择 以全血作为待测标本 时，一般使用EDTA-Na2或枸橼酸钠， 不可使用肝素。 2. 保存全血样本用于DNA提取检测，可 4下短期保存，如用于RNA检测， 则 应在取血后尽快提取RNA。,三、外周血单个核细胞,外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液，裂解全血中的红细胞，经生理盐水数次洗涤，即可看到单个核细胞

5、。 保存 外周血单个核细胞如暂不提取核酸，可保存于-70下。,四、痰,特点 痰属于分泌物，痰标本中含有大量粘蛋白和杂质。 处理 1、如作结核杆菌DNA测定标本，提取核酸前，需对标本进行初步处理，即用 1mmol/LNaOH液化。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。 保存 液化标本如不立即用于核酸提取，可保存于-70下。,2、如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本的处理只能室温悬浮于生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。,五、棉拭子,使用PCR方法检测性疾病病原体时，临床标本一般为棉拭子，可将棉拭子置于适量生理盐水中，充分震

6、荡洗涤后，取上清立即离心，其后的沉淀即可用于DNA提取。 保存 如不立即用于核酸提取，则需保存于-70下。,六、脓液,脓液的处理依情况而定。 如用于分枝杆菌（如结核杆菌）核酸测定的标本，粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心，沉淀用于生理盐水洗2-3次后，即可用于DNA提取。,对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本，如过于粘稠，则加入适量生理盐水，充分振荡后，静置，取上清立即离心，沉淀用于DNA提取；如为水样，则按上述直接离心取沉淀即可。 保存 沉淀标本的保存条件同样为-70。,七、体液,临床体液标本包括胸水，腹水，脑脊液，尿液等，可按水样标本的方

7、式直接离心取沉淀提取核酸。沉淀样本的保存同上。,八、组织,组织分新鲜组织块和石蜡切片。 新鲜组织块的处理步骤 首先用生理盐水洗两次，然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀，离心，弃上清，再加蛋白酶K消化后提取核酸。 保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小于1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边摇边加入无水乙醇至浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4可保存6年。,保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小于1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边摇边加入无水乙醇至浓度为50

8、%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后可进行DNA提取。,小结,1、标本的收集及适当的预处理，对用于PCR测定的核酸模板的成功提取，具有决定性作用。 2、要着重强调的一点是，所有用于上述临床标本收集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌。,PCR污染与对策,PCR反映的最大特点是具有较大扩增能力与较高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，机器微量的污染即可造成假阳性的产生。 实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次试验中的几个阴性对照结果中出现一个或几个阳性结果，提示本次试验中其他标本的检验结果可能

9、有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染扩增试剂污染扩增产物交叉污染等 常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA抽提、仪器、试剂及其他与扩增产物接触的物品。,PCR污染与对策,污染的原因 来自其他测试样品污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢出容器外，或容器外贴有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;微生物可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。,PCR污染与对策,污染的原因:来自实验材料或者配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。 “遗留”污染。这是PCR反应中

10、最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），高于PCR检测的拷贝极限，所以极微量的PCR产物污染，就可以造成假阳性。,PCR污染与对策,污染的原因:还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形成是气溶胶污染，在空气中与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作是比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。,PCR污染与对策,防治污染的方法: 严格实验室分区及其他实验用品及吸样枪应专用。实验前实验室应用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA. 吸样枪：由于操作时不慎

11、将样品或模板核酸吸入枪内或黏在枪头上，是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。,PCR污染与对策,防治污染的方法: 分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，PCR反应液应预先配置好，然后小量分装，-20保存，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰箱。 防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、离心管应一次性使用,PCR污染与对策,防治污染的方法: 每次PCR实验务必做阳性对照、阴性对照、阴性对照它包括标本对照： 被检的标本是血清就用

12、鉴定正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖的液体甩至管底部，开管动作要轻，以防管内液体溅出。,PCR污染原因分析,实验室污染的检测 一、如果阴性对照标本的扩增结果为阳性 原因：1、实验室扩增产物的污染。2、实验室操作所致的样本间的交叉污染，如强阳性标本气溶胶加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温时崩开等。3、扩增反应试剂的污染。阳性结果说明上

13、述三个环节中有可能在一个或几个环节中出了问题。,PCR污染原因分析,试剂（扩增反应混合液）扩增的结果为阳性原因：扩增试剂发生污染， 如想鉴别试验室是否发生污染，可将一个或多个空管打开，静置标本制备区3060分钟，然后加入扩增反应混合液扩增，如为阳性，则说明实验室以前扩增产物的存在，污染了整个实验室。 试剂（扩增反应混合液），用水替代核酸样本扩增，如为阴性，说明试剂质量是好。,关于PCR假阳性问题,PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。

14、PCR的假阴性却不同，他涉及了PCR实验的人员和技术环节，十分复杂。就临床而言，三大阳检出率低，或PCR检测阴性经常发生，可见假阴性问题的严重性。,PCR假阴性问题总体来说有如下因素：,一 仪器因素 PCR实验对仪器的依赖性是很高，离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。扩增仪的主要的影响是孔间差，引起扩增失败或扩增效率降低。 而离心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用离心加速度（XXXg）,作为参考指标，由于离心机的大小不同，有效离心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大（有的在数倍以上），造成PCR假阴性。这个问题在其他实验也有，但因其他实验都是测大分子蛋白沉淀，对

15、离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注意这个问题。,试剂质量问题 PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Tap酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。,核酸模板问题,核酸模版质量是制约PCR最重要的因素之一。核酸模板在扩增区出现断裂、蛋白粘附等模版质量问题，都有可能引起扩增失败造成结果的假阴性或定量不准确。无论什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板质量虽然与试剂的质量有关但它不可能由试剂质量完全决定。 核

16、酸模板问题除了模板本身的问题外，还存在模板溶液中抑制Tap酶活性成分（如某些蛋白、离子等）作用，导致扩增效率降低甚至扩增失败的问题。,操作人员素质问题,PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误、由于RNA抽提降解、逆转录失败等等都能造成结果的假阴性。因此要求PCR的实验操作人员有良好的素质，能够严格遵守操作规则，并能敏锐的发现问题和解决问题。,生物安全柜的使用,生物安全柜 biosafety cabinet 防止操作过程中含有危害性或 未知微生物气溶胶散逸的空气 净化安全装置,II级生物安全柜 用于对人员、受试样本及环境进行保护且能

17、满足生物安全柜危险度等级为1、2、3级的病原体操作的生物安全柜。II级生物安全柜的前窗开口区向内吸入负压气流用以保护人员的安全；经高效过滤器过滤的垂直气流用以保护受试样本的安全；排出气流经高效过滤器过滤是为了保护环境不受污染。,生物安全柜知识简介 II级生物安全柜 二级生物安全柜是目前应用最为广泛飞柜型，是有前窗操作口的安全柜，操作者可以通过前窗操作口在安全柜内进行操作，对操作过程中的人员、产品及环境进行保护。,生物安全柜的使用 与注意事项,正确的使用生物安全柜 应遵循以下使用原则： 缓慢移动原则 物品平行摆放原则 避免震动原则 不同样品柜内移动原则 避免明火使用原则 定期进行安全柜防护效果的

18、评估,生物安全柜操作程序,一、制定操作步骤、列出明细表、准备好所有材料 二、用杀菌肥皂清洗双手、戴手套；高危险性操作 要穿隔离服，戴两副手套，手套和工作服可在 进行实验时将保护你不受到操作中生物因子的 危害，也可以防止人体所携带寄生菌对安全柜 工作区和实验样品的污染。,三、如果紫外灯正在工作，进入实验室后关闭紫外 灯，将前窗开至工作高度病开启荧光照明灯。 确保安全柜进气和排气区域没有物体阻碍或干 扰，开启安全柜的风机进行预热5分钟，这程 序可以清楚安全柜工作区内可能经空气传播的 污染物，并有助于稳定安全柜的气流。调节工 作椅的高度，是你的肩膀和前窗下缘平行，这 样可以确保你的面部在前窗的保护之

19、下，病有 给予你足够的操作空间。,四、使用适当的消毒液如70%的乙醇擦拭工作区表面包 括前方的进气格橱。选择适合并有效的消毒剂主要根 据安全柜内实验的微生物种类和实验内容所决定。用 消毒剂擦拭实验用品后再将他们移入安全柜内的工作 区域内，检查实验用品明细表，确保所有的实验用品 都齐备，实验操作一旦开始后，在安全柜内移入或取 出任何物品都是不允许的，请特别注意前方的进气格 橱上不允许堆放任何实验物品，否则会阻碍气流的进 入，对气流造成干扰会影响安全柜的性能。,五、安全柜的工作区域不允许放置过多的物品，安全柜工作区应该划分为三个区：洁净区、工作区、污染区。这三个区域的界定可减少洁净物接触污染物品的可能，反之亦然。生物危害性物袋应放在污染区；实验仪器和样品应放在工作区；实验供给品应放在洁净区内，在工作台面的实验操作应从洁净区到高污染区的方向进行。,六、当你在安全柜内操作时请遵循移动原则，操作当中手臂应尽量平缓移动，为了避免影响正常的气流状态，尽量减少手臂的水平横向移动，手臂进入和离开工作区水平纵向姿势。,七、生物安全柜可以有效控