第三周微生物分离纯化接种与培养技术.ppt

1、,、微生物纯培养技术,纯培养基本步骤：,(2) 培养,(1) 分离,自生固氮菌的分离纯化,细菌的分离纯化,一、目的要求： 1、学习微生物纯系分离、培养方法。 2、掌握划线分离纯化微生物的方法。 二、基本原理： 为了生产和科学研究的需要，往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离。,第一节 微生物纯培养,二、微生物纯培养技术,1、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。 基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程,涂布,倾注,梯 度 稀 释 过 程,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,固体培养基分离纯培养,、稀释倒平

2、板法：稀释不同稀释液少许与50oC左右的琼脂培养基混合倾入平皿。 2、涂布平板法：稀释倾入平皿不同稀释液少许涂布在琼脂培养基。 3、平板划线分离法：少许待分离物平板划线（连续划线和分区划线）。 4、稀释摇管法：待分离物用培养基稀释摇匀在琼脂表面封石蜡。,液体培养基分离纯培养 同一稀释度做多个平行管，95%表现为不生长 。,二、微生物纯培养技术,4) 操作要点： 无菌操作,稀释平板分离法使用过程中的几个问题,1) 梯度稀释度的确定： 需分离微生物在样品中的数量,2) 选择菌落接种的依据： a、菌落特征； b、菌体的特征,3) 微生物纯培养的标准： 菌落特征一致性,固体培养基分离纯培养,菌落:单个

3、微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时。 平板（培养平板）：它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。,3、平皿划线法 用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。,2、单细胞挑取法： 从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。,单细胞（单孢子）分离,在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单细胞（单孢子）培养。 选择培养分离 1、利用选择培养基进行直接分离。 2、富集培养（多次培养后

4、再分离） 二元培养物：培养物中含 有二种微生物。 寄生物如病毒 ，原生动物如纤毛虫。,为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则其培养基中是不能含有N源，这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌，往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红，链霉素和金霉素等化学药品，目的在于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培养。 tupian,土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是由

5、微生物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。 要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基这种选择培养基，控制其适宜环境条件，使它在培养基上大量繁殖，然后通过稀释法和划线分离纯化法，使它在培养基上形成单菌落，如分离所得不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种.,三、材料与仪器,1、培养基：阿斯毕无氮培养基。 2、菜园土。 3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等,四、方法与步骤,（一）富集培养： :(上次已做实验) 1、加入1ML土壤菌悬液于灭菌平板 2 、加入已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯毕培养基，混匀。 3、正面放置培养箱中培养，28oC培养34天后，在土粒周围有混浊半透明的胶

6、状菌落出现，有的在后期会产生褐色的色素。,（二）划线分离纯化,1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板。 2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进行划线分离，而后置28oC培养4天。 划线方法如图：,1,2,3,4,（三）纯化、镜检，得到纯种培养,1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中，28oC培养4天。 2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大，常呈单个或“8”字排列，在细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。如有杂菌，需要进一步划线纯化。 3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培养基斜面管，28oC培养34天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用。,五、注意事项：,（1）在微生物分离、纯化每一操作环节，要严格按照无菌操作进行。 （2）平板划线时，划线部位不可重叠。 （3）划线时，每次都要将接种环上多余菌体烧掉。 （4）培养皿要贴标签，包括班级、姓名,六、思考题