噬菌体展示技术.ppt

1、噬菌体展示技术,Phage Display Technology 浙江大学医学院传染病研究所 贾红宇,噬菌体(bacteriophage,phage),是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 在电子显微镜下有三种形态： 蝌蚪形、微球形和丝形。,丝状噬菌体,大肠杆菌丝状噬菌体是一类单链环状DNA病毒，主要有M13,fd和fl三种。 噬菌体DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，而且可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。 只感染含F因子的大肠杆菌。,Phage structure:,M13 Gene Functions,Gene Function Amino Acids Mol W

2、t II DNA Replication 410 46137 X DNA Replication 111 12672 V Binding ssDNA 87 9682 VIII Major capsid protein 50 5235 III Minor capsid protein 406 42522 VI Minor capsid protein 112 12342 VII Minor capsid protein 33 3599 IX Minor capsid protein 32 3650 I Assembly 348 39502 IV Assembly 405 43476 XI Ass

3、embly 108 12424,Fiber structure,噬菌体肽库展示的发展史,此技术的形成基于两方面理论，早在1986年Geysen认为： （1）含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定簇 （2）多数情况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了蛋白质全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部肽段间的相互作用来实现的；上述两点为肽库的提出奠定了理论基础。,噬菌体肽库展示的发展史,噬菌体显示技术(phage display technique)最初描述于1985年，Smith将一基因片段与噬菌体的fdtet基因III连接，发现前者编码的多肽能以融合蛋白的形式出

4、现在噬菌体的表面，并可与特定的抗体相结合。,，1988年Parmley和Smith将B-Gal表达于噬菌体的表面，并证实该蛋白有生物活性，可以被相应的抗体识别。随后，许多有功能的蛋白都被表达于噬菌体的表面，包括分泌性蛋白(如抗体、生长激素)、细胞内蛋白和酶类，为这些蛋白的基因工程改造奠定了基础。 从理论上讲，任何蛋白只要能够分泌到细菌周质腔均可被表达于噬菌体的表面。 他们建立了一种新的表达载体：可选择抗体的丝状噬菌体fd载体，它能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面，可以用亲和筛选法筛选表达特异肽序列的噬菌体，通过测定噬菌体的DNA序列就可以知道所表达的肽段的氨基酸序列。,1990年，George

5、等证明噬菌体不会因外源性DNA片段的插入而影响其本身的粘附、侵入及整合。这种带有外源性基因片段的噬菌体感染宿主菌表达出外源性基因产物和PIII的融合体融合壳蛋白，由于PIII的特殊定位，外源性片段得以在噬菌体表面表达，并同时保持了本身的三维结构和功能，进而使噬菌体成为一个理想的携带工具。,1990年，Scott, Cwirla和Devlin三个小组几乎同时报道了用Fd或M13构建随机6肽，并用已知抗原决定簇的抗体和亲和素作筛选剂。Scott和Cwirla的结果表明用抗体选择出的肽的保守序列DFLE和YGG分别与抗原决定簇DFLEKI和YGGFL的部分序列一致，证明此方法设想正确。,噬菌体展示技

6、术（PDT）,是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。 它将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选新技术。,展示文库的特点,富集程度高，由此建立的展示文库的滴度可达106-1012 位置明确，噬菌体的PIII蛋白定位特殊，定位于噬菌体的尾部，其氨基末端为噬菌体结合F纤毛 噬菌体的衣壳蛋白有很大的可塑性 大部分的蛋白质都可在其表面表达,噬菌体展示文库按噬菌体分类,单链丝状噬菌体展示系统 P III 展示系统，主要用于获得高亲和力的克隆，形成单价表面展示体系 P VIII

7、展示系统，主要用于筛选亲和力较低的克隆，形成多价表面展示体系 P VI 展示系统,T4噬菌体展示系统 其病毒颗粒在宿主细胞内组装，不经过分泌途径，因而其表面展示多肽的范围更广，尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质 噬菌体展示系统 （同上）可展示有活性的大分子蛋白（100kDa以上）以及对宿主细胞有毒性的蛋白，在后基因组时代前景相当可观,噬菌体展示技术的应用原理,将待选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因之间，每一个噬菌体只含有一个外源基因，即每一个噬菌体只表达一种外源肽或蛋白，且呈现在噬菌体表面，而且不影响噬菌体的完整性。利用展示的多肽与目的蛋白（主要是抗体、抗原及一些细胞生

8、长因子受体等）或其他生物大分子亲和的性质可高效率的筛选出特异多肽。,噬菌体展示技术的应用原理（Panning),将已经建立好的噬菌体文库进行淘选 所谓淘选，是将展示文库作为流动相，而将与欲选择的重组基因产物的特异性的配体（或称靶分子）作为固定相，洗去不能与固定相特异结合的文库大部分成员，将特异结合的成员留下进一步扩增，并反复数轮淘选，即可将无用的基因去掉而将有用的基因富集并分离出来。,基本过程,基因插入 蛋白表达 建库 靶分子暴露（包被） 靶分子与噬菌体结合 洗脱 扩增,Panningprocessing,最显著的意义,引申出分子库的概念，使得建立各种文库（如随机多肽文库、蛋白质文库）以及体外

9、筛选任何目的分子成为可能。 对靶分子的结构无需深入了解。,噬菌体肽库展示的优越性,（1）噬菌体表达的融合蛋白或肽直接与编码它们的基因相关联，将活的噬菌体繁殖扩增便可以鉴定和分析结合肽或蛋白的序列 。 （2）噬菌体展示肽或蛋白的结构和功能常常与天然肽或蛋白具有同样或极为相似的结构和功能，利用此特点，在天然蛋白质或特定功能的构架分子库中，以一定功能的靶分子筛选，可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白。,噬菌体展示文库的用途,用途1 生产高效低价疫苗 它能方便地大量生产疫 苗用抗原表位，可以在同一噬菌体上展示多 个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价 疫苗。,用途2,研究诊断

10、用疫苗 （两种情况） 1 在抗原决定簇已知的情况下，构建重组噬菌体可以为血清学分析提供大量的抗原来源，因为它不需要裂解宿主细胞而直接分泌到培养基中；抗原制备纯化简单，成本低下；噬菌体颗粒稳定，易于长期保存；能在同一个噬菌体同时展示不同的病原体的抗原决定簇。,2 在预先不知道诊断用靶抗原的情况下，使用患者血清从抗原决定簇库中筛选出展示特异性抗原决定簇的噬菌体，这种噬菌体只能与病人血清抗体反应，而不能与正常人的血清反应，从而建立起疾病的特异性诊断方法。,用途3,筛选酶抑制剂 Norgren等利用该技术筛选到了7种酶系种的6 种抑制剂，Dennis从肽库中筛选到能非竞争 性地抑制丝氨酸蛋白因子VII

11、a活性的肽段,用途4,构建噬菌体抗体库 抗体库是指免疫球蛋白可变区基因片断的重 排而产生的各种抗体的总和，噬菌体抗体库 是指在噬菌体表面衣壳蛋白N端展示有抗体 Fab(fragment antigen binding)或scFv(single chain Fv).已经筛选到的血管内皮生长因子的 人源化抗体作为治疗肿瘤的药物已进入临床。,用途5,构建cDNA文库 一般利用M13噬菌体，但只能表达一部分 的真核蛋白，主要原因是融合蛋白形成受无 效蛋白转位的影响，所以应用受到很大的限 制。,应 用,利用噬菌体展示技术构建随机肽库、蛋白质库和抗体库研究受体或抗体的结合位置；改造和提高蛋白质、酶和抗体的

12、生物学和免疫学属性； 研究用于检测治疗用途的新型多肽药物、疫苗和抗体； 研究涉及到蛋白质识别或蛋白质与核酸相互作用的生物学过程； 研究新型的基因导向系统等。,应 用,从噬菌体表位随机肽库展示技术问世至今短短的几年里，噬菌体表位随机肽库得到了广泛的应用。用于筛选的靶分子包括抗体、膜受体、酶及其他的功能蛋白、培养细胞、血清样品。综合近期国际、国内杂志上发表的有关这方面的文章，现归纳如下：,应用举例,（1）以单克隆抗体作为靶分子，确定相关的抗原表位 （2）以纯化的蛋白质或其他分子为靶分子,确定它们的结合位点 （3）寻找大型功能蛋白质的小分子模拟肽 （4）以病人的血清或其他体液为靶分子，分离与鉴定疾病

13、特异抗原模拟肽 （5）以细胞为靶分子，筛选能结合细胞和器官的特异肽 （6）以病毒为靶分子，筛选出能抑制病毒的多肽,以单克隆抗体作为靶分子，确定相关的抗原表位,例如以针对脂多糖（内毒素）保守表位的单抗2B4为靶分子，对随机12肽库进行亲和筛选，得到12个结合力较强的噬菌体克隆做鼠伤寒杆菌和大肠杆菌脂多糖的竞争性抑制实验，抑制作用非常明显，结果表明了用2B4抗体筛选到的噬菌体短肽克隆可以模拟保守表位，为脂多糖的模拟肽。随着继续的深入研究，这一小肽将有望进一步开发为抗脂多糖的广谱疫苗和拮抗剂。,以纯化的蛋白质或其他分子为靶分子,确定它们的结合位点,目前对于梭菌的神经毒素还没有有效的解毒剂，为了对这方

14、面进行研究，Zdanovsky等以梭菌的神经毒素为靶分子，用随机肽库来筛选。筛选得到3个小肽，尽管它们与毒素的作用底物并不相同，但它们都能够抑制毒素的活性；同时如果改变小肽的氨基酸残基，就会失去它们的抑制毒素的活性。,寻找大型功能蛋白质的小分子模拟肽,Wrighton等从噬菌体肽库中筛选出了能够模拟红细胞生成素（EPO）的具有活性功能的环肽，展示了噬菌体展示在这一领域的应用前景。他们先在环八肽库中筛选出可溶性重组红细胞生成素受体(EPOR)胞外区的结合肽。可是作为游离可溶性的环肽，对EPOR的亲和力却很低。为了找到高亲和力的肽，又设计构建了第二个库。在得到的肽的中央引入突变，两边又各加三个随机

15、残基，以使表位延长至14个氨基酸。用EPOR继续筛选。结果筛选出的肽对EPOR的亲和力提高了10-50倍。,以病人的血清或其他体液为靶分子，分离与鉴定疾病特异抗原模拟肽,用抗-HCV核心抗体单独阳性的血清, 对已构建的HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库进行4轮筛选, 测定和分析7个杂交阳性克隆的DNA序列。结果所测定的7个序列中, 6个为HCV核心蛋白序列, 其中5个被正确地展示于噬菌体表面, 1个可能被正确展示, 这些序列均含有重要的HCV核心抗原表位。,以细胞为靶分子，筛选能结合细胞和器官的特异肽,Wang等以MUC-1高表达的乳癌细胞为靶分子，用随机肽库筛选。筛选出6个小肽用ELISA、F

16、ACS和直接免疫荧光法验证，结果它们可与乳癌细胞特异性结合，同时它们的结合可被抗原阻断。其中4个小肽可识别MUC-1核心蛋白亲水区域POTRP序列。此筛选出的小肽可能会成为抗肿瘤药物的特异性载体。,以病毒为靶分子，筛选出能抑制病毒的多肽,田波等从随机肽库中筛选出与完整草鱼出血病病毒颗粒特异性结合的短肽分子，并能有效地中和病毒，阻止病毒感染。这一崭新有效的途径提示了应用肽库技术在体外筛选抗病毒制剂的可能性，并为高效抗病毒短肽制剂的设计打下基础。,噬菌体展示的局限性,(1) 由于受大肠杆菌转化效率的限制,高效转化大肠杆菌的转化效率为107-109,故一般肽库的容量只有109, 所以高于这一限制的众

17、多基因将难以表达。 (2) 从建库开始，密码子的选择与寡核苷酸的合成，即编码肽的基因就带有一定的偏爱性，这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局限性。 (3) 作为噬菌体的宿主，大肠杆菌的生物合成系统有本身的表达限制，如不能进行氨基酸的修饰，蛋白质的糖基化或不能合成D型氨基酸等。,噬菌体展示的新进展,T7SelectTM 噬菌体展示系统是Novagen开发的基于T7噬菌体(而非传统的M13)创新的基因发现研究产品。目的序列(C-端)与T7基因10 衣壳蛋白而表达得到的多肽和蛋白即可暴露(展示)与病毒(T7噬菌体)的表面。复制周期短，细胞质蛋白组装，操作和储存方便，超高克隆效率，以及T7噬菌体强大的天然特性使Novagen的T7Select成为替代传统M13系统的更好选择，用于高效文库构建和生物淘洗。,T7与M13噬菌体的优劣比较,比较项目 T7 M13 小肽表达方式裂解性表达 穿膜分泌 小肽插入端口C-端融合 N-端融合 插入片段稳定性 稳定 1kb就不稳定 噬斑生长情况 12小时 洗脱条件 易于洗脱 较脆弱 克隆效率 高 相对较底,Ph.D. 噬菌体表面展示肽库试剂盒(Ph.D. Phage Display Peptide Library Kits),NEB提供了3种随机肽库和供自制肽库所需的M13KE克隆展示载体。这3种肽库包括7肽库（Ph.D.-7），12肽库（