噬菌体检测技术.ppt

1、1.噬菌体的基础生物学，戴夫霍格苏，噬菌体的本质。噬菌体只感染细菌。病毒携带基因组从一个敏感的细菌细胞到另一个。核酸基因组编码蛋白质或脂蛋白涂层(或衣壳)。共同构成核衣壳每个噬菌体的靶宿主都是一组特定的细菌，这些细菌严格来说是寄生的，携带着所有指导复制的信息，但缺乏能量产生的机制和地球上最丰富的生命体，90%以上的噬菌体属于尾部噬菌体，近一半的病毒体是双链DNA，另一半是由蛋白质聚集形成的具有二十面体和交叉五聚体的头部。面部六聚体尾的形态可分为三个科：60%属于长尾噬菌体，25%属于短尾噬菌体，15%属于肌尾噬菌体，具有基本的噬菌体形态，“家庭照片”:噬菌体29和T2。德怀特安德森提供的电子显

2、微照片。T4噬菌体的数量表明了基因编码的每个结构。生活方式如下：强毒或温和的传染性噬菌体可以选择性地启动一个溶源循环；它不是复制溶源状态，而是高度进化的结果，这需要病毒和宿主的共同进化，也许反映了它们在许多方面的优势。温和噬菌体可以帮助保护其宿主免受其他噬菌体的感染，并且可以引导具有显著宿主特征变化的强毒噬菌体。通常，它编码许多宿主致死蛋白、噬菌体感染过程、吸附：当尾丝或尾钉结合到特定的表面分子或粘多糖壳时，尾噬菌体的感染开始，并且任何蛋白质、寡糖和脂多糖开始。T4样噬菌体必须将六条长尾丝中的至少三组与初级受体分子结合，以触发尾板成分的重排，然后不可逆地与次级受体结合。这个家族的不同成员使用完

3、全不同的初级受体，但是他们似乎都使用庚基作为他们的次级受体。渗透：不可逆吸附后，基因组通过尾部进入宿主细胞，但实际上不是“注射”。噬菌体尾部具有穿透肽聚糖层的酶机制，然后接触或穿透内膜，将DNA直接释放到细胞中；尾部结合还会形成一种机制，阻止衣壳中的脱氧核糖核酸输出，直到它完全位于潜在的宿主细胞中。从宿主到噬菌体的定向代谢转化：最初的步骤通常包括噬菌体启动子对宿主核糖核酸聚合酶的强识别，从而导致早期和早期基因的转录。这些基因的产物可以保护噬菌体基因组，重建宿主以满足噬菌体的需要；它们可以灭活宿主蛋白酶并阻断限制性内切酶，直接终止各种宿主大分子的生物合成，或破坏一些宿主蛋白质。一组中期基因通常随

4、后被转录，导致新噬菌体DNA的合成，接着是一组编码噬菌体颗粒组分的晚期基因。对于一些噬菌体，这些转化包括合成新的()因子或DNA结合蛋白以适应宿主的核糖核酸聚合酶；而其他人编码他们自己的核糖核酸聚合酶。宿主基因的降解和抑制宿主基因的翻译是其他机制，可以促进细胞适应合成新的噬菌体。形态发生：在大多数噬菌体中，它们的组装涉及特定骨架蛋白和主要头部结构蛋白之间的复杂相互作用，接着是蛋白水解以分裂骨架蛋白和主要头部结构蛋白的氮末端。在包装之前和包装过程中，头部会膨胀并变得更加稳定，同时适合于脱氧核糖核酸的内部体积也会增加。位于头部的顶点是一个入口复合体，它成为头部组装的起点、脱氧核糖核酸包装酶的对接位

5、点、穿过脱氧核糖核酸的管道以及肌尾噬菌体和长尾噬菌体的噬菌体尾(分别组装)结合位点。细胞溶解：这是一种紧急事件，其时间受到严格控制。如果裂解发生得太早，很少有新的噬菌体能确保有效地继续这一循环；如果裂解延迟太久，重复感染和新的爆发周期的机会将会丧失。尾部噬菌体使用两种成分进行裂解：赖氨酸，一种能分解肽聚糖基质中重要键的酶，和holin，一种在膜内聚集有孔的蛋白质，它使赖氨酸作用于肽聚糖层并在适当的时间促进裂解。时机受生长条件和遗传的影响。可以选择改变裂解时间的突变。T4感染循环，二。噬菌体检测技术，介绍，噬菌体和宿主细胞之间的特异性相互作用。一个自然进化的系统具有不同裂解谱的噬菌体，形成噬斑，

6、并区分物种或属之间细菌分离物的感染性差异，如细胞表面受体、限制性修饰系统、前噬菌体或携带质粒等。实验结果重复性高，成本低，是目前应用最广泛的菌株鉴定方法。将重组(信号)噬菌体、报告基因导入噬菌体生物发光(lux)基因，用照度计检测10个大肠杆菌/单位荧光素酶信号噬菌体(LRP)，检测肉和蛋中导入噬菌体的沙门氏菌luxAB基因的结构基因。利用转基因生物检测底物乙醛扩散和单核细胞增生李斯特氏菌酶的反应受到限制，信号基因(如lux、ina或gfp)被引入噬菌体基因组和包装在噬菌体颗粒中的重组DNA。信号噬菌体与标本混合，但只感染敏感的宿主，因此无需在测定前纯化生物体。感染后，信号噬菌体的基因组被复制

7、，信号基因被表达。一旦积累了足够的信号蛋白，就可以检测到表达的信号基因。噬菌体展示，彻底改变了用亲和技术结合特殊物质分离多肽的历史。克隆的序列与噬菌体外壳蛋白一起表达，嵌入成熟噬菌体颗粒中，并“展示”在成熟病毒颗粒的表面。它应用于医学或药学，鉴定各种病毒，区分念珠菌属物种，并检测棒状杆菌孢子。肽库片段被克隆为与Fd噬菌体基因III(小壳蛋白)或VIII(大壳蛋白)融合的蛋白质。如果肽与基因蛋白融合，只有几个拷贝的肽会显示在噬菌体上，但是可以形成没有互补性的功能性噬菌体。如果肽与基因蛋白融合，必须在宿主细胞中以反式形式提供野生型GPVIi，以合成含有融合到肽序列中的天然GPVIi和GPVIi的混

8、合物的活性噬菌体颗粒。噬菌体文库暴露于与支持物相连的靶向配体，未连接的噬菌体被洗掉。结合的噬菌体被提取并生长成具有所需键亲和力的足够数量的噬菌体。使用更严格的洗脱方法，重复生物淘析过程，最后分离具有最高结合亲和力的噬菌体。这些是斑块纯化和克隆插入序列分析。双噬菌体，不利用宿主噬菌体的特异性关系来完成检测项目。对目标分子特异的抗体共价连接到两种不同的转化噬菌体的表面。在这种检测中，使用了两种转导噬菌体，它们可以将两种抗生素的耐药基因转导到一个宿主细胞中。针对目标抗原的抗体与转导噬菌体化学结合；如果使用针对靶抗原不同决定簇的抗体，这种检测方法的特异性可以提高。这种抗体标记的噬菌体与靶抗原混合并允许

9、结合。样本与宿主细胞以适当的稀释比例混合，这确保了宿主细胞的随机共感染是罕见的事件。将感染的宿主细胞在含有两种抗生素的培养基上铺展，从而选择已经被双重转导的细胞。只有当噬菌体与相同的抗原颗粒结合并紧密聚集时才会出现这种情况(琼脂平板上的菌落代表阳性结果)。噬菌体扩增检测不使用任何修饰的噬菌体，检测终点是形成的噬斑。一个新的检测测试可以很快建立。为了应对新的困难细菌的出现，用目标病原菌感染的噬菌体可以逐渐形成噬斑，从而提供扩大信号的结果。这种检测方法需要未修饰的噬菌体。目标细菌的噬菌体与标本混合，允许感染易感细胞。一旦噬菌体进入隐藏阶段，添加杀病毒剂，但目标细菌不受影响。没有感染细胞的外部噬菌体

10、被杀死，只有存活的活性噬菌体是那些成功感染宿主细胞的噬菌体。然后中和杀病毒剂，将含有感染细胞的标本与支持噬菌体复制的辅助细胞混合(它们不一定与目标细菌相同)。将该混合物接种在琼脂平板上，并培养形成细菌苔藓。感染细胞中的噬菌体完成其复制周期，裂解宿主细胞，其后代感染细菌苔藓上的辅助细胞，导致斑块的形成。3.食品安全和噬菌体技术、人类健康和公共健康正面临挑战。世卫组织1996年的报告指出，我们正处于全球传染病危机的边缘，任何国家都不能幸免，任何国家都不能承担忽视这一威胁的后果。世界卫生组织2000年“世界卫生组织全球沙门氏菌监测”规划世界卫生组织2001年“世界卫生组织全球食品安全战略”，噬菌体技

11、术全面应用于控制食源性细菌性疾病，从农场到餐桌的食物链；监测是控制的基础，预防和消毒是手段。减少抗生素积累和耐药性传播的重要目标；噬菌体在食物链中发挥作用。沙门氏菌，志贺氏菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，裂解，扩增，预防和治疗，食品灭菌，国家标准，1CFU国家标准，应用推广，应用研究，技术路线，表1。噬菌体诊断试剂国内外同类技术参数/技术类型的比较。噬菌体裂解法、噬菌体扩增法、生化法、血清学法、自动分析仪法等，采用沙门氏菌、沙门氏菌等47种物品，组血清和物品大多由志贺氏菌、志贺氏菌等复杂但准确的亚组血清进行分析，但一些大肠杆菌、大肠杆菌等经典方法有重要的生化交叉项，属外金黄色葡萄球菌和种，这些不

12、能放入机器中，如氰化钾试验。纯文化需要检查。需要在纯培养后6小时、6小时、3-4天、3-4天和24-48小时进行检查。误诊和误判率极低，0.05%，0.05-0.5%，极低，高，高。你能认出这个属吗？可测试条件一般条件一般条件复杂的一般条件设备试剂昂贵的例行程序可能或可能不能大量测试可能或可能不能省略补救五个生化五个或更多生化不需要使用噬菌体使用历史超过20年国外3-4年长期近6-7年实用新技术。通用、有限、廉价、高1元/标本高度(与以前相同)、高、低、本地化程度、高、高、高、不高。国家标准是一项新技术吗？表2 .噬菌体杀菌技术参数/技术种噬菌体化学杀菌剂(或抗生素)动物沙门氏菌处理特异性鉴定

13、特异性鉴定无选择性相对广谱对微生态影响很小或无影响。耐药性(耐受性)很小，但未发现大的化学毒性。大研发周期短、短、长。资本投资不多，不多，不多，不多。无论食物链的积累有无长的有效半衰期和短的药物终止指数增长，使“药物”在感染部位的自我增殖不能增加分子代谢破坏谱中“全部或无”杀菌浓度的效果。噬菌体足以杀死一种特定的细菌，而杀死一种特定的细菌需要许多抗生素分子。在治疗的初始阶段，有不同的给药剂量和亚致死剂量。细菌有机会表达耐药基因并克服耐药性的能力。噬菌体是可以经历突变的“活”微生物，其中一些可以克服细菌抗生素的明确和不可改变的化学结构，并且不能适应突变。也就是说，突变噬菌体纤维可以用突变细菌受体进行某种细菌突变，从而变得过时。耐药性很好，或者突变的噬