GB∕T 38170-2019 琼脂糖分离介质

犐犆犛０７．０８０

犃２１

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犌犅／犜３８１７０—２０１９

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犃犵犪狉狅狊犲犫犪狊犲犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺犻犮犿犲犱犻狌犿

２０１９１０１８??２０１９１０１８??

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前言

本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。

本标准由中国标准化研究院提出并归口。

本标准起草单位：中国科学院过程工程研究所、中国标准化研究院、中科森辉微球技术（苏州）有限

公司。

本标准主要起草人：黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云。

Ⅰ

犌犅／犜３８１７０—２０１９

琼脂糖分离介质

１范围

本标准规定了琼脂糖分离介质的分类、技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和

贮存。

本标准适用于琼脂糖分离介质的生产与检测。

２规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

ＧＢ／Ｔ１９１包装储运图示标志

ＧＢ／Ｔ５４７５离子交换树脂取样方法

ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法

３术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

３．１

琼脂糖分离介质犪犵犪狉狅狊犲犫犪狊犲犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺犻犮犿犲犱犻狌犿

以琼脂糖为主要原料制备的一类球形分离介质。

３．２

非特异性吸附量犪犿狅狌狀狋狅犳狀狅狀狊狆犲犮犻犳犻犮犪犱狊狅狉狆狋犻狅狀

琼脂糖分离介质对细胞色素Ｃ的吸附量。

４分类

按琼脂糖含量分为４％琼脂糖分离介质和６％琼脂糖分离介质。

５技术要求

５．１外观要求

琼脂糖分离介质应球形饱满、表面光滑，在光学显微镜下应具有透明性。

５．２性能要求

应符合表１中的规定。

１

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表１琼脂糖分离介质的主要性能要求

项目

指标

４％琼脂糖分离介质６％琼脂糖分离介质

粒径

平均粒径（珚犱）／μｍ９０．０±１３．５３４．０±６．８９０．０±１３．５３４．０±６．８

范围粒径比（犠粒径）／％

≥９０

ａ

≥９０

ｂ

≥９０

ａ

≥９０

ｂ

最高流速ｃ／（ｃｍ／ｈ）≥２１０≥６０≥２７０≥６０

固含量／％７．５０±１．６０１０．５０±２．００

分配系数ｄ（犓ａｖ）

０．５８～０．７０（犕ｐ＝２０００００）０．４３～０．６２（犕ｐ＝２０００００）

０．６３～０．７５（犕ｐ＝１０００００）０．６８～０．８２（犕ｐ＝５００００）

０．７７～０．８９（犕ｐ＝２００００）０．７２～０．８６（犕ｐ＝１００００）

非特异性吸附量ｅ／（

μｇ

／ｍＬ）≤１８≤１８

菌落总数／（ＣＦＵ／ｍＬ）＜１００＜１００

５羟甲基糠醛脱落量／

（

μｇ

／ｍＬ）

ｐＨ３．０≤０．２５

≤０．２５

ｐＨ１３．０≤０．１５

≤０．１５

注：犕ｐ为探针分子相对分子质量。

ａ粒径在４５．０μｍ～１６５．０μｍ范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比。

ｂ粒径在２４．０μｍ～４４．０μｍ范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比。

ｃ在０．１ＭＰａ压力下可达最高流速。

ｄ以葡聚糖为溶质。

ｅ每毫升介质对细胞色素Ｃ的吸附量。

６检测方法

６．１外观

６．１．１样品处理

按照ＧＢ／Ｔ５４７５直接从产品中抽取５ｍＬ样品，置于５０ｍＬＧ３型号砂芯漏斗中抽干５ｍｉｎ。用符

合ＧＢ／Ｔ６６８２的三级水清洗５次，每次２ｍｉｎ，最后用真空泵在０．１ＭＰａ压力下抽干５ｍｉｎ。将洗净的

琼脂糖分离介质置于烧杯中，向其中补加三级水，保证琼脂糖分离介质上应有２ｃｍ的三级水。混匀后

得到琼脂糖分离介质与水的混合体系。

６．１．２样品观测

用塑料吸管吸取混合体系置于载玻片上，调整显微镜放大倍数。以视野里８０％以上面积均为琼脂

糖分离介质为标准，用塑料吸管增减载玻片上的琼脂糖分离介质，最后用盖玻片压上。调节光学显微镜

焦距，使视野中的影像清晰。拍摄琼脂糖分离介质照片并保存。

６．２粒径

６．２．１样品处理

方法同６．１．１。

２

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６．２．２样品检测

设置激光粒度仪参数如下：测量颗粒类型为通用型，分散剂类型为水，分析模式为单峰模式，添加样

品进行测定。

６．２．３结果计算

６．２．３．１范围粒径比

按式（１）计算：

犠粒径＝∑

狀

犽＝犻犠犽

…………（１）

式中：

犠粒径———范围粒径比，％；

犠犽———粒径为犽（μｍ）颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比，％；

狀———试样颗粒粒径在４５．０μｍ～１６５．０μｍ范围内，狀＝１６５；试样颗粒粒径在２４．０μｍ～４４．０μｍ

范围内，狀＝４４；

犻———试样颗粒粒径在４５．０μｍ～１６５．０μｍ范围内，犻＝４５；试样颗粒粒径在２４．０μｍ～４４．０μｍ

范围内，犻＝２４。

６．２．３．２平均粒径

平均粒径按式（２）计算：

珚

犱＝∑

狀

犽＝１犱

犽

犖

…………（２）

式中：

珚

犱———所统计的一定数量介质颗粒的平均粒径，单位为微米（μｍ）；

犱犽———单个颗粒的粒径，单位为微米（μｍ）；

犖———所统计的介质颗粒的数目。

在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。

６．３最高流速

６．３．１样品处理

方法同６．１．１。

６．３．２样品装柱

选用１．６０ｃｍ×２０．００ｃｍ的层析柱，堵住柱子出口，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，静置，

控制介质床层高度为１０．００ｃｍ±０．２０ｃｍ，柱子上端充满水。打开柱子入口，以０．５ｍＬ／ｍｉｎ的流速连

续向柱中通入１０个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。

６．３．３样品测定

将层析柱连入中低压层析系统。测定时，从零开始设定一定流速狏狓（ｍＬ／ｍｉｎ），保持该流速５ｍｉｎ

后，记录此时柱压狆狓（ＭＰａ）。继续增加流速，并测定相应流速下的柱压。直到压力达到０．１０ＭＰａ为

止，此时对应流速记录为狏０．１。

３

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６．３．４结果计算

最高流速按式（３）计算：

犉ｍａｘ＝６０

狏０．１

犛

…………（３）

式中：

犉ｍａｘ———最高流速，单位为厘米每小时（ｃｍ／ｈ）；

狏０．１———在０．１０ＭＰａ压力下的体积流速，单位为毫升每分（ｍＬ／ｍｉｎ）；

犛———层析柱截面积，单位为平方厘米（ｃｍ２）；

６０———分钟转化为小时的换算系数。

在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。

６．４固含量

６．４．１样品处理

方法同６．１．１。

６．４．２样品称量

将５ｍＬ琼脂糖分离介质与水的混合体系装入带１０μｍ孔径筛板的离心柱内，置于离心机，在

２０００ｒ／ｍｉｎ下离心５ｍｉｎ。取出离心管，将样品小心倒入称量瓶内，盖严。在已恒重的两个称量瓶中

分别称入１．０ｇ上述分离介质精确至０．１ｍｇ。

６．４．３样品烘干称量

将称量瓶开盖置于烘箱中，于１０５．０℃干燥至恒重。将称量瓶盖严，取出置于干燥器内，冷却

３０ｍｉｎ至室温，称量。

６．４．４结果计算

固含量按式（４）计算：

犠＝犿２－犿０

犿１－犿０×１００

…………（４）

式中：

犠———固含量，％；

犿１———干燥前称量瓶加试样质量，单位为克（ｇ）；

犿２———干燥后称量瓶加试样质量，单位为克（ｇ）；

犿０———称量瓶质量，单位为克（ｇ）。

在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。

６．５分配系数犓犪狏

６．５．１溶液配制

６．５．１．１１％（体积分数）丙酮溶液

准确量取０．１ｍＬ丙酮，加水混合，定容至１０ｍＬ。

６．５．１．２２犿犵／犿犔葡聚糖溶液

准确称取２ｍｇ葡聚糖，加水混合，定容至１ｍＬ。

４

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６．５．１．３缓冲液，

狆犎７．０

准确称取１０．９３ｇ十二水合磷酸氢二钠、３．０４ｇ二水合磷酸二氢钠和８．７６ｇＮａＣｌ，加水溶解，调

ｐＨ

为７．０，最后定容至１０００ｍＬ。

６．５．２样品处理

方法同６．１．１。

６．５．３样品装柱

选用１．００ｃｍ×３０．００ｃｍ的层析柱，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，堵住柱子出口，静置，

控制介质床层高度为３０．００ｃｍ±０．２０ｃｍ。打开柱子出入口，以一定流速连续向柱中通入１０个柱体积

的三级水，床层稳定后即可进行测试。对于９０μｍ介质，流速为９．０ｍＬ／ｍｉｎ，对于３４μｍ介质，流速为

６．０ｍＬ／ｍｉｎ。

６．５．４样品测定

用缓冲液以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的流速平衡层析柱至示差检测器信号基线平衡。上样１％丙酮溶液测定

丙酮的洗脱体积犞ｉ，上样相对分子质量犕ｐ＝２００００００葡聚糖测定洗脱体积犞ｏ。再将不同相对分子质

量的葡聚糖单独上样：对于４％琼脂糖分离介质依次是葡聚糖犕ｐ＝２０００００，葡聚糖犕ｐ＝１０００００，葡聚

糖犕ｐ＝２００００；对于６％琼脂糖分离介质依次是葡聚糖犕ｐ＝２０００００，葡聚糖犕ｐ＝５００００，葡聚糖犕ｐ

＝１００００。所有葡聚糖样品浓度为２．０ｍｇ／ｍＬ。上样量均为２００μＬ。

６．５．５结果计算

分配系数犓ａｖ按式（５）计算：

犓ａｖ＝犞ｅ－犞ｏ

犞ｉ－犞ｏ

…………（５）

式中：

犞ｅ———各样品的洗脱体积，单位为毫升（ｍＬ）；

犞ｉ———丙酮的洗脱体积，单位为毫升（ｍＬ）；

犞ｏ———相对分子质量犕ｐ＝２００００００葡聚糖洗脱体积，单位为毫升（ｍＬ）。

在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。

６．６非特异性吸附量

６．６．１溶液配制

６．６．１．１缓冲液犃，

狆犎７．０

准确称取４．３７ｇＮａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ和１．２２ｇＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ，加三级水溶解，调

ｐＨ

为７．０，最

后定容至１０００ｍＬ，用０．４５μｍ过滤膜进行过滤。

６．６．１．２缓冲液犅，

狆犎７．０

准确称取４．３７ｇＮａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ和１．２２ｇＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ和８．７６ｇＮａＣｌ，加三级水溶解，

调

ｐＨ

为７．０，最后定容至１０００ｍＬ，用０．４５μｍ过滤膜进行过滤。

６．６．１．３２．０犿犵／犿犔细胞色素犆溶液

准确称取２００．０ｍｇ细胞色素Ｃ于１００ｍＬ容量瓶，用１０ｍＬ缓冲液Ａ溶解，定容，配成２．０ｍｇ／ｍＬ的

５

犌犅／犜３８１７０—２０１９

标准储备液。上样前用０．４５μｍ过滤膜进行过滤。

６．６．１．４细胞色素犆标准工作溶液

分别取０．００ｍＬ、２．５０ｍＬ、５．００ｍＬ、１２．５０ｍＬ、２５．００ｍＬ、４０．００ｍＬ细胞色素Ｃ标准储备溶液至

１００ｍＬ容量瓶中，用缓冲液Ａ溶液稀释至刻度，配成０．００ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１０ｍｇ／ｍＬ、

０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５０ｍｇ／ｍＬ、０．８０ｍｇ

／ｍＬ标准工作溶液。

６．６．２样品处理

方法同６．１．１。

６．６．３样品装柱

选用１．６０ｃｍ×２０．００ｃｍ的层析柱，堵住柱子出口，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，静置，

控制介质床层高度为５．００ｃｍ±０．２０ｃｍ。打开柱子入口，以１．０ｍＬ／ｍｉｎ的流速连续向柱中通入１０个

柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。

６．６．４样品测定

以缓冲液Ａ平衡，流速为２．０ｍＬ／ｍｉｎ，蛋白上样５ｍＬ。经缓冲液Ａ淋洗至淋洗液没有蛋白出现，

再经缓冲液Ｂ洗脱，收集对应洗脱峰。记录洗脱峰体积犞Ｅ（ｍＬ）。用紫外分光光度计检测标准工作溶

液和洗脱峰在２８０ｎｍ处的吸光度犃２８０，以标准工作溶液的吸光度与蛋白浓度做标准曲线，通过标准曲

线定量洗脱峰蛋白浓度。

６．６．５结果计算

非特异性吸附量按式（６）计算：

犠Ｎ＝犆Ｅ犞Ｅ

犞ｇｅｌ

×１０００…………（６）

式中：

犠Ｎ———非特异性吸附量，单位为微克每毫升（

μｇ

／ｍＬ）；

犆Ｅ———洗脱峰蛋白浓度，单位为毫克每毫升（

ｍｇ

／ｍＬ），由标准曲线计算出；

犞Ｅ———洗脱峰体积，单位为毫升（ｍＬ）；

犞ｇｅｌ———琼脂糖分离介质的体积，单位为毫升（ｍＬ）。

在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。

６．７菌落总数

６．７．１样品前处理

方法同６．１．１。

６．７．２样品测定

参照《中华人民共和国药典》（２０１５年版）（１１０５）非无菌产品微生物限度检查———微生物计数法进

行。取１ｍＬ抽干介质，加入１ｍＬ三级水，采用涡旋混合器混匀样品。将含有３０ｍＬ胰蛋白胨大豆琼

脂培养基的锥形瓶１２１．０℃灭菌２０ｍｉｎ，放入４０．０℃恒温箱中，待培养基冷却到４０．０℃时，用微量移液

器吸取１ｍＬ混匀后的样品加入到该锥形瓶中，混匀，把混合物倒入培养皿中，盖好上盖。在室温下使

混合物凝固。把培养皿置于恒温箱中３５．０℃孵育５ｄ。

６

犌犅／犜３８１７０—２０１９

６．７．３结果计算

孵育期后检查培养皿，计数菌落形成单位数（ＣＦＵ）。

在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值应不超过５ＣＦＵ／ｍＬ悬浮液。

６．８５羟甲基糠醛脱落量

６．８．１溶液配制

６．８．１．１１０％（体积分数）甲醇水溶液

准确量取１００ｍＬ色谱纯无水甲醇，与９００ｍＬ二级水混合均匀，再用０．２２μｍ孔径的滤膜过滤，超

声除气泡。

６．８．１．２５羟甲基糠醛标准储备溶液

称取２０．０ｍｇ５羟甲基糠醛标准物质于１００ｍＬ容量瓶，用１０ｍＬ１０％甲醇水溶液溶解，定容，配

成０．２０ｍｇ／ｍＬ的标准储备液。

６．８．１．３１犿犿狅犾／犔盐酸溶液，狆犎３．０

量取０．０８３ｍＬ浓盐酸（１２ｍｏｌ／Ｌ）稀释定容为１０００ｍＬ，调节

ｐＨ

为３．０。

６．８．１．４１００犿犿狅犾／犔氢氧化钠溶液，狆犎１３．０

称取４．００ｇ氢氧化钠固体，溶于１００ｍＬ三级水中，待冷却至室温后用三级水定容为１０００ｍＬ，调

节

ｐＨ

为１３．０。

６．８．１．５标准工作溶液

分别吸取５羟甲基糠醛标准储备溶液５μＬ、１５μＬ、２５μＬ、４０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ至

１００ｍＬ容量瓶中，用１０％甲醇水溶液稀释至刻度，配成０．０１

μｇ

／ｍＬ、０．０３

μｇ

／ｍＬ、０．０５

μｇ

／ｍＬ、

０．０８

μｇ

／ｍＬ、０．１０

μｇ

／ｍＬ、０．２０

μｇ

／ｍＬ、１．００

μｇ

／ｍＬ、２．００

μｇ

／ｍＬ标准工作溶液。现配现用。

６．８．２样品处理

清洗方法同６．１．１。然后取若干份１．００ｇ抽干琼脂糖分离介质置于带盖玻璃试管内。分别取

１０ｍＬｐＨ３．０、ｐＨ１３．０的溶液置于各试管内，样品管在４０．０℃条件下培养。７ｄ后，将上层清液转移

到干净的试管内。

上层清液经旋转蒸发（６０．０℃，５０ｒ／ｍｉｎ），定容至２ｍＬ，加入等体积１２ｍｏｌ／Ｌ盐酸，１００．０℃水解

１ｈ。定容至５ｍＬ。用０．４５μｍ的滤膜过滤，得到样品待测液。

６．８．３样品测定

高效液相色谱条件：色谱柱选择Ｃ１８，５μｍ，２５０ｍｍ×４．６ｍｍ（内径）；流动相是１０％甲醇水溶液；

流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长２８５ｎｍ；柱温３０．０℃；进样量１０μＬ。

以上述高效液相色谱条件对标准工作溶液和样品待测液进行检测。记录标准工作溶液的保留时间

以及峰面积，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线。以标准工作溶液的保留时间对样品进行定性，并

记录下该保留时间处峰的面积，用标准工作曲线对样品进行定量。

７

犌犅／犜３８１７０—２０１９

６．８．４结果计算

５羟甲基糠醛脱落量按式（７）计算：

犡＝

犆犞

犿×１．４

…………（７）

式中：

犡———介质中５羟甲基糠醛的脱落量，单位为微克每毫升（

μｇ

／ｍＬ）；

犆———从工作曲线求得的试样溶液中５羟甲基糠醛的浓度，单位为微克每毫升（

μｇ

／ｍＬ）；

犞———试样经盐酸水解后最终的定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；

犿———称取的琼脂糖分离介质的质量，单位为克（ｇ）；

１．４———琼脂糖分离介质质量转化为体积的换算系数。

在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。

７检验规则

７．１组批

同一工艺周期生产，质量均一的产品为一批。

７．２抽样

按ＧＢ／Ｔ５４７５的规定进行。

７．３出厂检验

每批产品出厂前应进行检验，检验合格的产品方可出厂。出厂检验项目为第５章中规定的