目的基因的原核诱导表达及SDSPAGE凝胶电泳.ppt

1、目的基因的原核表达及SDS-PAGE凝胶电泳、现代分子生物学大实验、实验目的， 重点掌握表达运载体建构的原理和方法目的基因原核表达原理和方法掌握目的蛋白“标签条”纯化的基本原理和方法掌握PAGE改性凝胶电泳的原理和方法目的蛋白诱导表达目的蛋白纯化的目的蛋白检测、实验原理、蛋白表达：将爱沙尼亚克朗基因插入适当的运载体导入宿主细胞球在体内难以分析各个蛋白质的作用进行大量的表达和纯化，是为了在体外进行研究应用于蛋白质的纯化、定位及功能分析等， 图pet 14b-his-tat-EGFP-p38-16 peptides融合蛋白的Hela细胞球落射荧光显微镜检测(400酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细

2、胞球表达系统表达的蛋白质正常活性、构象技术难度大、费时费力，大肠菌群表达系统实验技术简单， 时间短、费用低、系统比较完整不能修饰加工重组蛋白质，容易形成包涵体，原核细胞表达系统真核细胞表达系统、实验原理、原核细胞表达系统菌株内生的经典BL21系列是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们熟知的表达菌株。 著名的BL21(DE3 )融源菌添加了T7多聚酶基因，为T7表达系统而进行了修订。实验原理、原核表达质粒的建构目的基因表达运载体、实验原理目的基因/DNA/PCR /酶催化剂切断/Primer示例： p38中抑制多晶肽16肽序列ggaagaacattgttcctggtacagaccattgatt

3、gattgagttgagttctggt-3 r5- ACG gaggagtta gag CTT cat 在G-3 5末端自变量中，AC是有机保护盐化学基，G GAT CC是BamH I酶催化剂片断，TA是为防止转移而引入的2盐化学基，并查询密码16肽的前7个氨基酸的盐化学基序列。 3端引物中的AC是随机保护盐化学基，G GAT CC是BamH I酶催化剂位点，TAA是琥珀突变的反互补序列，和从查询密码16肽盐化学基序列的最后的盐化学基开始的反互补序列。 实验原理、表达运载体构成表达运载体，是基于可将外源基因载送到大肠菌群细胞球的基本骨架添加表达元件。 元件启动子、终止子、核糖体识别序列诱导表达

4、所需元件操纵子序列调控基因多克隆位点融合Tag复制起始序列筛选标记/报告基因各种表达运载体的差异在于其表达元件的差异。 实验原理、启动子强弱是决定表达量的主要因素之一。 从转录模式来看有组成型表达和诱导调控型表达。 lac和Tac、PL和PR、T7是最常用的启动子，包括转录终止子的核糖体结合位点、启动子、终止子、核糖体识别序列、操纵子序列和定径套的调控基因、电感性表达所需的元件、多克隆位点复制起始序列、实验原理， 用于分离的运载体蛋白称为标签条蛋白的标签条位于表达运载体多克隆位点的n末端或c末端，并且可以与目的基因融合表达(n末端或c末端融合表达)。 目前常用的标签条是组氨酸标签条(His-T

5、ag )谷胱甘肽s转换酶(GST-Tag )过氧化物(thioredoxin，Trx )标签条麦芽糖结合蛋白质。 对小分子使用GST等大的Tag得到稳定的表达，另一方面，一般的基因多选择小的Tag (例如His )，减少对目标蛋白质的影响。 实验原理、筛选标记/报告基因表达了抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，kana、新霉素、抗四环素、红细胞吉卜赛人素和氯霉素。对于抗性基因的选择，代谢研究中要注意的是抗性基因查询密码的酶催化剂与代谢物是否相互作用是留心等是否干扰作用在研究对象上。 GFP (绿色荧光蛋白)是最常用的报告基因，是半乳糖苷酶、萤光素酶。 部分融合表达Tag也有报告基因的功能。

6、实验原理、常用表达运载体pGEX系列运载体是谷氨酰胺S-转换酶(GST )融合蛋白表达系统的运载体。 Ptac Promoter Amp pGEX - KG pET系列的运载体是His6融合蛋白的表达运载体。 T7 Kana pET - 14b、实验原理、目的蛋白诱导表达lacI q(Lactose) lacI是大肠菌群中lac操纵子的调节基因，其表达的抑制蛋白存在作为lac操纵子基因(Operator )抑制因子的乳糖时， 该抑制蛋白与过量的乳糖结合失去对操作基因的抑制，使lac操作子上的结构基因lacZ(-半乳糖苷酶)、lacY (通透性酶催化剂)、lacA (乙酰转换酶)正常表达，并开始

7、转录。 IPTG (异丙基d1硫代半乳糖苷酶)作为乳糖的类似物与lacI抑制蛋白结合，不抑制操作基因，因此IPTG常被用作lac操作子的诱导剂。 从实验原理、实验原理、BamH I、酶催化剂切割、Nde I、基因片断、酶催化剂切割后的目的基因、酶催化剂切割、连接、转化、筛选(蓝)实验原理、目的蛋白质的纯化、细胞球医学超声破碎、溶菌工作团队分解、细胞球蛋白质中纯化GST和His融合蛋白质GST是谷胱甘肽由于GST对谷胱甘肽的亲和性非常高，所以可用谷胱甘肽硬化后的亲和色谱法树脂纯化GST及其融合蛋白，最后可溶出用含有游离谷胱甘肽的缓冲液结合在一起的GST融合蛋白。 由于Poly His多组氨酸可以

8、与多种过渡金属或过渡金属螯合物结合，因此具有HIS-6的蛋白质可以与固化的Ni2树脂结合，用适当的缓冲液(PBS )洗涤除去其他杂蛋白质后，用可溶的网络冲突鳌合剂(咪唑)洗提，可以回收营销对象蛋白质实验原理、目标蛋白质检测蛋白质分子量检测SDS-聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳目标蛋白质分析、实验原理、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳(SDS-PAGE )是目前测定蛋白质分子量的最佳方法。 SDS是一种强的阴络离子型清除剂，破坏分子内和分子间的氢键，折叠分子，破坏蛋白质分子的二次和三级结构。 在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，强还原剂如巯基乙醇和二硫苏糖醇切断半胱氨酸残化学基之间的二硫键，通过

9、加热使蛋白质解离。 解离的氨基酸侧链与SDS结合，形成带负电荷的蛋白质SDS复合体。 在实验原理、蛋白质中加入SDS进行加热，SDS分子上的非极性区域(黄色尾部)与蛋白质上的非极性区域结合使蛋白质变性，形成线状的长分子，在其上充满SDS分子。 SDS分子的极性区域(品红色的点)为了提高亲水性而向外突出。 SDS是一种阴络离子界面激活剂，阻断氢键与疏水力，以一定比例与蛋白质分子结合形成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过了其自身本来的电荷，掩盖了各种蛋白质分子间天然电荷的差异。 SDS最终将蛋白质变成负电荷高的线性分子。、97.0 kDa，实验准备，诱导，培养37恒温摇摆阳离子电泳检测hoefe

10、rminiveverticalelectrophoresissystem，仪器和设备，LB培养基，Amp，IPTG 30%亚克力酰胺贮液1。 1.5M Tris(PH8.8 ) (隔膜) 10%SDS、10%过硫酸铵(AP )、四甲基乙基二铵(TEMED) 1XTris-甘氨酸阳离子电泳缓冲液： 25mM Tris 10%甘油， 取0.1%溴酚蓝染色液： 90甲醇： 90冰冰乙酸： 20水0.5g R-250脱色液： 90甲醇： 90冰冰乙酸： 20水、实验试剂、实验步骤、培养诱导试样制备SDS-PAGE 50ul的一晚培养物，加入含有氨西林(50ug/ml )的LB培养液3ml 3 )吸出5

11、00ul未被诱导的培养物放入一个微量离心管中，在室温下高速离心1分钟，沉淀悬浮在100ul 1 x SDS凝胶添加缓冲液中，在100度下加热3min，在室温下高速离心1分钟，放置在冰上。 4 )在剩下的佗培养物中加入IPTG，加入浓度1mmol/L、37，继续培养3h，取500ul的样品放入微量离心管，在室温下高速离心1分钟。 使悬浮在100ul 1 x SDS凝胶中的样品缓冲液沉淀，100度加热3min，室温下高速离心1min，放置在冰上，所有样品处理完毕后等待上面的样品。 目的蛋白质的诱导表达和检验，6 )清洗阳离子电泳槽玻璃板，干燥，用白凡士林密封，7 )配合7)12%分离橡胶，将配合的

12、分离橡胶立即放入凝胶槽内，用蒸馏水密封至凝胶槽高度的三分之二。 糨糊凝固后(用一炷香将水去掉，用吸水纸吸上来8 )，配合5%浓缩糨糊，将配合好的浓缩糨糊立即放入凝胶槽(放入梳子不溢出比较好)，放入梳子9，糨糊凝固后，拔出梳子，放入阳离子电泳槽10 )，将调制好的样品放入样品孔11 聚丙烯酰胺凝胶制备(mini VE )、目的蛋白的检测-亮蓝染色、亮蓝R250(coomassie brilliant blue )是一种三苯基甲烷纺织染料，也称为酸蓝83，能检测0.1ug以上的蛋白质带。 将凝胶浸渍在染色液中，室温下在摇床上慢慢染色4小时(或一夜)。 脱染：回收染液，凝胶用蒸馏水漂洗一次，浸泡在脱染液中脱染，在室温下浸渍凝胶或37进行加热脱色，并多次更换脱色