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文档简介
1、1.单核苷酸多态性检测方法,2007年4月12日,2。单核苷酸多态性的定义:单核苷酸多态性主要是指基因组水平上由单核苷酸变异引起的DNA序列多态性。(99.9%)。3.SNPs的重要性。1.作为第三代遗传标记(可知性、遗传性和可检测性),单核苷酸多态性被用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。_ _ _ _路标的作用传统研究策略(表征、蛋白质、基因)反向遗传学(表型、基因、蛋白质),4,2。研究遗传多态性和单核苷酸多态性对身体的影响(生理特征和病理条件差异很大),5。单核苷酸多态性的研究进展和方向,1。SNPs数据库的构建和发现2。SNPs功能的研究。1.检测单核苷酸多态性的理想方法是发现未知的单核苷
2、酸多态性,或者检测已知的单核苷酸多态性(1)对灵敏度和准确度的要求(严格的反应原理),(2)快速、简单和高通量(操作和分析的高度自动化),(3)相对较低的成本,7,2。现状:到目前为止,还没有理想的方法满足上述条件,但根据实际情况,可以将每一种SNPs的检测方法分为两部分:区分SNPs特定位点的原理方法和数据的检测分析手段。9。SNPs检测方法的分类,1。区分SNPs位点的方法1。基于杂交的方法2。基于酶3的方法。基于构象4的方法。直接测序法2。检测和分析技术1。凝胶分析技术2。荧光检测技术。DNA芯片4。质谱检测技术10,1。方法基于杂交原理,短核苷酸探针可根据杂交复合物与互补靶片段杂交时的
3、不同稳定性,在完全匹配和错配两种情况下检测单核苷酸多态性位点。(差异越大,检测的特异性越好。)11,1)使用Tm,固定温度等位基因特异性寡核苷酸探针。修饰探针:引入错配碱基、肽核酸、低聚氨基酸等动态加热过程,动态等位基因特异性杂交,12肽核酸,其骨架特征为肽键:1。它以高特异性结合靶分子(受三个方面影响);2.链拥挤(形成三链复合结构)(表达调控和反义治疗);3.它对核酸酶和蛋白酶不敏感(体外应用);13、1。它以高特异性结合靶分子,Tm值高,受盐浓度(低盐浓度体系)和较大Tm的影响小。14,LNA(锁定核酸),其结构是一个“桥”,连接核糖分子的2个羟基和核糖环的4个碳原子之间的亚甲基。特点:
4、1 .它能与互补的脱氧核糖核酸、核糖核酸或LNA蛋白以高亲和力结合(构象更有利于杂交的稳定性)。匹配和错配的Tm增加,15,Dash(动态等位基因特异性杂交),16,2)杂交荧光共振,分子信标(双分子杂交),蝎探针(分子内杂交),17,分子信标),18,蝎引物,19,2。基于酶的方法,1)DNA聚合酶2)连接酶3)限制性内切酶4)核酸外切酶FEN 5)RNase H,20,1)DNA聚合酶,等位基因特异性聚合酶多重等位基因特异性聚合酶Taqman引物延伸焦磷酸测序法,21,等位基因特异性聚合酶链反应,22,Taqman法,23,微测序法/引物延伸法,24,基本步骤(液相),1。设计聚合酶链反应
5、扩增一段含有单核苷酸多态性位点的基因;2.纯化聚合酶链反应产物(去除引物和脱氧核糖核酸);3.延伸引物;4.检测延伸产品(放射性同位素标记、发光检测、基于凝胶的荧光检测、质谱、变性高压液相色谱等。);25.顶点(排列引物延伸)固相,26,焦磷酸测序),脱氧核糖核酸聚合酶,三磷酸腺苷硫酰化酶,荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶。原理:DNA聚合酶在dNTP存在下进行引物延伸反应,引物成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶存在下可诱发化学发光反应,通过实时监测光度计达到检测的目的。27,基本步骤:1 .测序引物和脱氧核糖核酸模板之间杂交(聚合酶链反应扩增,单链),与酶和底物温育。2.将四种dNTP(DatP,dTTP,dCTP,dGTP)中的一种加入到反应体系中,例如与模板配对,与引物末端形成共价键,并释放DntP的焦磷酸基团(PPi)。3.一系列酶促反应发出可见光信号。每个光信号的峰值高度与反应中结合的核苷酸数量成比例
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