限制性核酸内切酶

1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶是识别特定的核苷酸序列，切断各链特定部位两个核苷酸间磷酸二酯类化合物结合的酶催化剂，简称为限制性酶催化剂。 限制性核酸内切酶催化剂是由细菌产生的，其大姨妈意义是提高自身防御能力。 限制酶催化剂一般不切断自身的DNA分子，只切断外来DNA。 根据限制酶催化剂的结构、辅助因子的需求切换和作用方式，限制酶催化剂可分为三种类型，分别为第一型(Type I )、第二型(Type II )和第三型(Type III )。 限制性核酸内切酶可同时催化宿主DNA的甲基化和非甲基化DNA的水解作用。 型限制性核酸内切酶仅催化非甲基化DNA的水解作用。 型限制性核酸内切酶兼有修饰

2、和认知切断的作用。 第一类型限制酶催化剂充当云同步和识别切割，并且能够识别DNA上的特定盐化学基序列，通常，其切割部位是识别部位。(recognition ) 例如： EcoB、EcoK。 第二型限制酶催化剂只具有识别切断的作用，修饰作用由其他酶催化剂进行。 大量的所辨识的位置的短回文序列被剪切的盐化学基序列通常是标识的序列。 是遗传工程科学实用性很高的限制酶催化剂种。 例如： EcoRI、Hind。 第三型限制酶催化剂与第一型限制酶催化剂类似，对云同步具有修饰识别截断的作用。 可以识别短的非对称排列，切断位置和识别排列大约相隔24-26碱基对。 例如： Hinf。 大姨妈意义、限制作用是实际

3、限制酶催化剂降解外源DNA1，维持宿主遗传稳定的保护反应历程。 甲基化是一种常见的修饰作用，可以将腺三嘌呤a和胞嘧啶c甲基化保护。 通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外源遗传物质的目的。 因此，产生细小病毒防止感染限制酶催化剂的细菌在其自身的染色体组中可能有其酶催化剂可识别的序列，但只有其识别序列和酶催化剂切点被甲基化。 但是，一旦甲基化，并非所有的限制酶催化剂都不能切断。 由于许多限制酶催化剂对DNA甲基化敏感，限制酶催化剂靶序列与甲基化位点重叠，对酶催化剂切割的影响不产生，部分影响，有3种可能完全抑制。 对甲基化DNA的切断能力限制了酶催化剂内和不可预测的特性，因此，为了有效地切断DNA

4、，在云同步中需要考虑DNA甲基化和限制酶催化剂这种甲基化的易感性。 另外，几乎所有的商业限制酶催化剂现在都专注于甲基化DNA的切断。 限制酶催化剂的应用，自发现型限制酶催化剂以来，受到越来越多的生化学家的欢迎，限制酶催化剂对DNA分子有专一性的切入点，因此为人们在分子水平上切割分析和重组遗传信息提供了重要的工具。 (1)用限制酶催化剂将用于染色体DNA分析的DNA切成一系列片段，利用多亚克力冷却胺或琼脂糖凝胶电泳，简单地分离这些个片段，测定它们在凝胶中的移动速度，或者直接在电子显微镜下观察，由此测定它们的大小。 这些个的东鳞西爪按染色体组整体的排列顺序，主要以几种不同的限制性酶催化剂对DNA进

5、行部分水解作用，并对产物进行阳离子电泳分析。 用同样的方法，DNA中的各脱氧核普酸的顺序分析也是可能的。 也就是说，可以使用多种限制酶催化剂将染色体DNA片断切成小块，如果片断彼此重叠，则分析DNA片断重叠的脱氧核安慰剂的序列，用现在的生化方法是没有问题的。 (二)特定DNA复制的起点或终点的位置DNA复制开始后，分离DNA，用限制酶催化剂处理，用电子显微镜观察从哪里开始复制，Fareed等人利用EeoRI特定了sV40DNA分子的复制起点。 同样，也可以定位RNA在DNA上的转录位置，例如如果单孢杂交不与标识牌RNA标识牌的DNA，就可以知道该RNA是从哪个DNA转录的。(3)基因的甲基化研

6、究HPal只能识别切断双链DNA分子中的ccGG的顺序，其中Cyt需要甲基化的MPsI识别了相同的顺序，但其中Cyt必须被甲基化。 因此，有人利用这一对限制酶催化剂来研究照片核基因的甲基化程度(1)。 (四)在DNA重组分子生物学研究中发现的多种核酸酶类，被当作一个基因工程的工具。 其中能够识别特定的回文序列并切断DNA双链的类限制性核酸内切断酶催化剂，广泛应用于DNA重组技术。 (五)建构运载体采用5个末端导入限制酶催化剂Xcm酶催化剂位点的一对引物，以水稻品种日本晴化学基凶组DNA为铸造模型，扩增627 bp的PCR片段，并将其与pGEM-T Easy运载体连接，限制得到txia重组运载体

7、的酶的作用位点，质粒、质粒多将有用目的的DNA片段通过重组DNA技术送到接纳体细胞球，进行繁殖和表达的工具称为运载体(Vector )。 细菌质粒是重组DNA技术中常用的运载体。 质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。 由于质粒具有某些遗传信息，所以可使宿主细胞球具有遗传性状。 其自我复制能力和所具有的遗传信息在重组DNA操作如放大、筛选过程中极为有用。 质粒载体基于天然质粒建构人造的以适应实验室操作。 与天然质粒相比，质粒载体通常具有多克隆位点序列，包括一个或多个选择性标识牌基因(如抗生素抗性基因)和合成于人造的的多个受限酶催化剂识别位点，以去除大部分不需要的序列，并尽可能减少分子量和促进基

8、因工程操作。 许多质粒载体具有多种用途的辅助序列，这些个的用途包括用组织化学方法肉眼鉴定重组爱沙尼亚克朗、产生测定序列的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。 理想的爱沙尼亚克朗载体可以插入具有两个以上遗传标记的大的外来DNA片段，这些片段具有分子量小、多拷贝、松弛控制型，以及多拷贝、松弛控制型通常需要的许多常见限制酶催化剂的单接点对宿主细胞球无害。 常用的质粒载体大小一般在1kb到10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和蓝牙脚本(简称PBS )等。 在细胞球复制、质粒的细胞球内复制中，通常有密集控制型(Stringent control

9、 )和松弛控制型(Relaxed control )两种。 前者只在细胞周期的某个阶段进行复制，染色体不被复制时，也不能复制。 通常，每个细胞球中只包含一个或多个质粒分子，如f因子。 后者的质粒可以在整个细胞周期中随时复制，每个细胞球有很多拷贝，一般像Col E1质粒一样有20个以上。 使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时，可抑制细胞球内蛋白质合成、染色体DNA复制、细胞分裂，终止紧密型质粒复制，但松弛型质粒继续复制，质粒复制数可从原来的20个增加到1000-3000个， 在这种情况下，质粒DNA的总DNA含量可由原来的2%增加到40-50%，利用相同复制系统的不同质粒不能共同存在于同一宿主细胞球中，

10、当两个质粒被导入到同一细胞球中时，在复制和随后分配给子细胞球的过程中就发生了网络冲突在一个细胞球中，一个质粒占优势，另一个细胞球中，另一个质粒占优势。 由于当细胞球几代生长时，会失去占少数的质粒，因此，在细胞球的后代中只有2种质粒的1种，这一现象被称为质粒的不相容性(Incompatibility )。 但利用不同复制系统的质粒可稳定共存于同一宿主细胞球中。质粒通常含有查询密码某种酶催化剂的基因，其显性性状包括对抗生素的抗逆性、产生某种抗生素、降解复杂的有机物、产生大肠菌群和肠毒素，以及产生某种限制酶催化剂和修饰酶催化剂等。 质粒图像、大肠菌群质粒的分子结构图像、pBR322质粒、pBR322

11、质粒DNA分子的长度为4361 BP * (* sequencingdatafromwatson (confirmedatnewenglandbioland Inc.) haa 361basepairs，not 4，363 basepairsaspreviouslyreported.)已知该运载体有2个标记基因，一个是氨西林抗性基因的pBR322DNA分子具有24种核酸内切断限制酶催化剂的单一识别位点。 其中7种限制酶催化剂(从12:00的位置开始顺时针方向)即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、Xma和NruI的识别站点位于抗四环素抗性基因的内部， 另外，两种限制酶催化剂C

12、laI和Hind的识别位点在该基因活性区域内的3种限制酶催化剂ScaI、PvuI和PstI的识别位点在氨苄青霉素抗性基因内，如果在这些个的位点插入外来DNA，则导致ampr基因的失活。 由pBR322质粒载体的结构可知，具有分子量小的优点。 经验表明，为了避免DNA纯化过程中链断裂，爱沙尼亚克朗载体的分子大小最好不要超过10Kb。 pBR322质粒这一小分子量的特征不仅容易纯化自身DNA，而且可容纳大量的外来DNA片段。 可将两种抗生素抗性基因用作感受态的选择符号形成了表明运载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞球，以及外源DNA分子是否进入运载体分子的重组子。 标记基因多为宿主细胞球提供新的表

13、型，该转化细胞与非转化细胞明显区分。 如果在某个标记基因中插入DNA片段，那么该基因就会失去与之相应的功能。 把这个重组DNA分子转移到宿主细胞球的话，那个遗传因子原来所给予的表型也消失了。 如果保留原来的表型转化细胞，那么细胞球内所含的DNA分子一定不是重组子。 显然，该运载体必须具有至少两个标识牌基因，才能同时指示外源DNA是否进入宿主细胞球，以及外源DNA片段是否插入运载体DNA分子中。 此外，pBR322质粒载体具有高拷贝数，而且在氯霉素放大后，可以按细胞球存储10003000拷贝，非常便于重组体DNA的制造。 常用的人工质粒运送运载体为pBR322、pSC101。 pBR322包括抗

14、抗四环素基因(Tcr )和抗氨西林基因(Apr )，其包括27种限制性核酸内切酶的单一识别位点。 pBR322质粒作为常用的基因克隆运载体，在实际应用中具有非常重要的地位，其中一个突出的例子是以pBR322为爱沙尼亚克朗运载体对水稻叶绿体光诱导基因psbA进行结构分析。 应用例1是将水稻叶绿体的DNA用EcoRI核酸限制酶催化剂消化后，放入含有溴化乙锭的低熔点(LMP )的1%琼脂里肌肉凝胶中电泳分离。 从LMP中分离出分子大小为1.82.5kb的DNA片断，经同样的EcoRI核酸限制酶催化剂切断，与用碱磷酸酯酶进行了脱磷酸处理的pBR322质粒连接。 然后将混合物感受态大肠菌群5346菌株，

15、在氨西林选择平板上培养，形成Ampr感受态子菌落群。 就这样构成了用EcoRI核酸限制酶催化剂切断的水稻叶绿体基因组基因组文库。 可以将Ampr转化子的菌落和32P放射性标识牌玉米的psbA DNA探针进行菌落杂交，分离出其中的阳性爱沙尼亚克朗体。 从这些个的阳性爱沙尼亚克朗体分离的重组体质粒DNA，经过一头地先进的分析，可以测定水稻叶绿体基因psbA的序列。 应用例2是也经常提到以pBR322为载体重组人体生长抑制荷尔蒙激素的应用例。其过程与水稻叶绿体基因重组相似，除了在质粒载体中插入抑制生长的荷尔蒙激素基因外，还将含有lac操纵子起始部分的片段(含有启动子、操纵子区、核糖体结合位点和半乳糖苷酶的主要部分)插入抑制生长的荷尔蒙激素基因一侧。 lac操纵子的调控使得调节重组基因产生的蛋白质变得相对容易。 应用例-3，目的监视MSAP甲基化检测过程，控制MSAP的各个反应步骤。 方法以PBR322质粒作为阳性对照，在MSAP分析中全程监测酶催化剂断开、连接、预扩散和选择扩散系统。 结果PBR322质粒作为阳性对照阳离子电泳时的乐队是有限的，可根据乐队的有无和位