凯氏定氮法测定食品中蛋白质课件

1、凯氏定氮法测定食品中蛋白质,一、概述,蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的含氮化合物，它是由20种氨基酸通过酰氨键以一定方式结合，并具有一定的空间结构。,生理功能及在食品中的作用,常见食物中蛋白质的含量,牛肉,螺旋藻,常见食物氮系数,氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用6.25表示。,蛋白质测定方法,二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白）,凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。 1.原理,2.实验步骤,第一步：样品消化,样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液中,（1）消

2、化 总反应式：,消化装置 “自动回流消化仪”,定氮消化的不同状态,RCH2(NH2)COOH+H2SO4CO2+H2O+SO2+ (NH4）2SO4,澄清,消泡,碳化,消化过程中试剂作用,硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程； 硫酸铜（蓝绿色）：催化作用,(NH4)2SO4+2NaOHNH3+Na2SO4+2H2O,第二步蒸馏,注意事项：,(3）吸收与滴定 吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液， 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂。,各步骤操作细节图解：,样品消化蒸馏滴定 （1）样品消化,样

3、品+0.4g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒,先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟,45度角,消化终点,瓶口不能对着人,盖上小漏斗,（2）蒸馏,将消化液全部转移 到100ml容量瓶中,加10ml硼酸溶液和混合指示剂23d,加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色,通入蒸汽开始蒸馏,冷凝管下口浸入硼酸溶液中,取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。,吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸

4、馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源,（3）滴定,取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至终点。,滴定前,滴定终点,同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。,实验注意事项消化,（1）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化 （2）消化至呈透明后，继续消化30分钟，一般消化时间约4小时 （3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂 （4）样品不易澄清时可冷却后加入30%过氧化氢2-3ml,小结,自动凯氏定氮仪法,在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。 仪器：,消化炉,自动蒸 馏装置,1、原理及适用范围 2、特点： （1）消化装

5、置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。,双缩脲法（分光光度法）,1.原理双缩脲反应 碱性条件下、双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配合物的反应。 肽键（-CO-NH-）与双缩脲结构相似、能呈现此反应。 560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。,KOH、CuSO4、酒石酸钾钠配置,标准曲线,标准曲线（standard curve）是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。,2.标准曲线绘制,（1）配置一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液； （2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中； （3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，振摇、静止1h； （4）取上清液在2000r/