第九章 维生素类药物的分析 - 浙江大学.ppt

1、第九章 维生素类药物的分析,维生素是维持人类机体正常代谢功能所必需的一类活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节，体内不能自行合成，须从事物中摄取。这类药物的分析方法很多，有生物法、微生物法、化学法和物理化学法，但目前常用的分析方法是化学法或物理化学法。,第一节 维生素A的分析,维生素A包括有 a. 维生素A1（视黄醇）活性最强 不饱和脂肪醇 主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油。在鱼肝油中维生素A多以各种酯类混合物的形式存在，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。 b.维生素A2（去H 维生素）30%-40% c.维生素A3（去水维生素）0.4%,一 结构和性质,（一）结构 维生素A的结构为具有

2、一个共轭多烯醇侧链的环己烯，具有许多立体异构体。维生素A多为全反式。不同的异构体具有相似的化学性质，但具有不同的光谱特性和生物效价。 （二）性质 1.溶解性 由于是有机物，所以具有脂溶性，溶于乙醚、石油醚等有机溶剂中，在乙醇中微溶，在水中不溶。,2.不稳定性 由于有多个不饱和键，所以性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，易被紫外光所裂解，特别是在加热和金属离子存在是，更易氧化变质，生成无生物活性的环氧化合物维生素醛或维生素酸。维生素A对酸不稳定，遇Lewwis 或无水氯化氢乙醇液，可发生脱水反应。其中V.A的醋酸酯比V.A稳定。由于不稳定性，所以应保存在凉暗处，并需充氮气或加入合适的抗氧剂。,

3、3。紫外吸收特性 在325-328处有最大吸收，可用于鉴别和含量测定 4.与三氯化锑呈色 V.A在氯仿溶液中能与三氯化锑作用，产生不稳定的蓝色。可用于鉴别或用比色法测定含量,二. 鉴别实验,（一）三氯化锑反应 1.原理 V.A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中即显蓝色，渐变成紫红色。 2.机制：V.A和氯化锑（ 三价）中存在的亲电试剂氯化高锑（五价）作用形成不稳定的蓝色碳正离子。 3.方法 见书P207,4.注意事项 无水无醇条件下进行及其原因：水可使三氯化锑水解成氯化氧锑，而乙醇可以和正离子作用使其正电荷消失。所以仪器和试剂必需干燥无水，氯仿中应无醇。 （二）紫外吸收光谱法 1.方法 配制溶

4、液，并立即用紫外分光光度计在300-400nm的波长范围内进行扫描，则应在348、367、389nm的波长处有三个尖锐的吸收峰，且在332的波长处有较低的吸收峰或拐点。 2.讨论 最大吸收波长与共轭程度有关：共轭程度越大，其波长也就越大。具体情况见P208,（三）薄层色谱法,第一种： BP（2000） 吸附剂：硅胶G 流动相：环几烷-乙醚（80：20） 显色剂：三氯化锑,第二种：USP（24） 硅胶 环几烷-乙醚（80：20） 磷镭酸,三.含量测定,先用紫外分光光度法代替反应专属性差、呈色不稳定的三氯化锑比色法。但由于三氯化锑比色法操作简便、快速，所以目前仍旧是食品或饲料中V.A含量测定的常用

5、方法。 （一）紫外分光光度法（三点校正法）,1.三点校正法的建立,V.A在325nm-328nm的波长范围内具有最大吸收，可用于含量的测定。但其中有很多杂质在紫外区也有吸收，而干扰V.A的准确的含量测定。其中有其多种异构体、氧化降解产物、合成中间体和副产物等。采用“三点校正法”能够消除这些杂质的无关吸收的干扰。,什么是“三点校正法” ？,三点校正法是指在三个波长处测得吸收度后，在规定的条件下以校正公式进行校正，再进行计算。这样就可以消除无关吸收的干扰。 注：V.A在325nm-328nm的波长范围内有最大吸收，其最大吸收波长随溶剂的不同而有所不同。具体数据见P209 表9-3。,2.测定原理,

6、两点原理： （1）.杂质的无关吸收在310nm-340nm的波长范围内几乎成一条直线，且随波长的增大吸收度下降。 （2）.物质对吸收呈加和性的原理。 3.波长的选择 选择原则：一点选择在维生素A的最大吸收波长处 ，其他两点选择在的两侧各选一点（ 第一法（等波长差法） 第二法（等吸收比法）,4.杂质的吸收 对V.A有影响的杂质主要有以下几种： (1) V.A2 和V.A3 (2)维生素A的氧化产物 (3) 维生素A在光照下产生的无活性的聚合物 (4)维生素A的异构体等。 以上这些杂质在310nm-340nm的波长范围内有吸收，干扰维生素A的测定。,5.测定方法,（1）第一法（直接测定法，适用于纯

7、度高的维生素A醋酸酯） 1）方法 见书上P210 2）计算 a.吸光系数E1%1cm b.求效价（IU/g）： c.求维生素A醋酸酯占标示量的百分含量,3）换算因子： 4）A值的选择： a.计算吸收度比值：与中国药典的吸收度比值相比较，判断每个差值的绝对值是否超过0.02。 b.判断法 最大吸收波长在326-329nm之间，且5个波长下的绝对值差值均不超过0.02时，可直接用328nm波长处的测得的吸收度值求得吸收系数。,最大吸收波长不在326-329nm之间，计算5个波长下的绝对差值，如果有一个或几个超过0.02，这是应按以下的方法进行判断： 若（A328校正-A328）*100%/A328

8、 所得的数值的绝对值在3.0%，则仍不用校正公式计算吸收度。可直接用A328代入E=A/C.L 若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值的绝对值在-15.0%到-3.0%，则应用A328校正代入E=A/C.L 若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值的绝对值在小于-15%或大于+3%，则不能用本法测定，应使用第二法。,如果最大吸收波长不在326-329nm之间，也不能用本法测定。 第一法的校正公式为： A328校正=3.52（2 A328 A316-A340）,（2）第二法（皂化法，适用于维生素A醇）,1）方法 精密称取一定量的供试品，加KOH乙醇溶液后

9、煮沸回流，得到的皂化液再经过提取、洗涤、滤过、浓缩和干燥等处理，最后用异丙醇溶解残渣并稀释成每1ml中含维生素A为9-15个国际单位数的溶液，在300、310、325、334nm波长处测定吸收度，并确定最大吸收波长（应为325nm）。 2）计算 同第一法。看书上p210-211,3）A值的选择,如果最大吸收波长在323-327nm之间，且A300 /A325比值0.73，表示供试品中杂质含量太高，应采用色谱法将未皂化部分纯化精辟再进行测定。,第二法的校正公式： A325校正=6.815 A325 2.555A310-4.260A334 6.讨论 1）.吸收度校正方法： 维生素A醋酸酯：直线方程

10、法（代数法） 维生素A醇：相似三角形法（几何法或6/7定位法） 2）.在应用三点校正法时，除其中一点是在最大,吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生较大误差。因此，在测定之前务必要校正波长，并可用全反式维生素A进行测定，比较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对波长是否准确。测定的样品不得少于两份。 7.应用示例 维生素A胶丸、维生素AD胶丸和维生素AD滴剂等均可采用本法测定。,（二）三氯化锑比色法,1.原理 维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用，产生不稳定的蓝色，在618nm-620nm的波长处有最大吸收，符合Beer定律。 2.方法

11、 配置溶液，加入一定量的三氯化锑氯仿溶液以后，在5-10s内，于620nm处测定吸收度，绘制标准曲线。按同法测定供试品溶液的吸收度，根据标准曲线计算含量。 3.注意事项 （1）要求操作迅速 （2）反应介质应无水,（3）温度对呈色强度的影响很大，样品滴定时的温度应绘制标准曲线时的温度相差的绝对值应在1摄式度以内。否则应重绘标准曲线。 （4）反应并非维生素A专属，在相同情况下，某些物质也会与三氯化锑反应生成显蓝色，常使测定的结果偏高。 （5）三氯化锑具有腐蚀性，所以使用时应该当心。,（三）高效液相色谱法,采用RP-HPLC法同时测定人血清中维生素A和维生素E的含量。 1.仪器： 2.分析用样品液：

12、 对照品：维生素A、维生素E 、维生素A醋酸酯 血清样品制备：,采血后立即离心，置5ml塑料试管中，充氮、密封，于-40摄式度保存备用。,精密量取血清200微升，精密加入含一定浓度内标溶液的无水乙醇200微升，振荡30s，精密加入正己烷，离心，取正己烷层100微升进样。 3.方法与结果,线形关系：模拟样品提取液配比 、连续进样3次 、 用峰高比对浓度作图 维生素A的回归方程： 维生素E的回归方程： 检测量： 问：检测量与被检测物质及其浓度和进样量有关吗？ 回收率试验： 精密度试验：用正常人的血清样品进行精密度试验，由回归方程计算实际浓度。,4.讨论 对吸收特性不同的物质采用不同的波长和灵敏度。 虽用维生素A醋酸酯做内标测定维生素E的含量，尽管两者的化学性质相差很大，但因其测定波长和灵敏度的不同，结果还是较满意的。 样品处理方法简便、结果准确，样品经液-液萃取就可以进样，省去了氮气流条件下的蒸发等步骤，缩短了分析时间。,4）排除了样品中的 干扰物质，方法专属性强。可用停留扫描及吸收度比测定技术对样品中retinol和a-tocopherol与已知对照品