第34讲-基因工程及蛋白质工程-一轮复习.ppt

1、第34讲 基因工程,考点一基因工程的操作工具,考点二基因工程的操作过程与应用,考点三蛋白质工程,启动子,能识别启动子并与结合位点结合，催化DNA转录（合成）出RNA。也有解旋DNA的作用。,RNA聚合酶,终止子,原核细胞的基因结构,RNA聚合酶识别和结合位点,阻碍RNA聚合酶的移动，从DNA模板上脱落,不能编码蛋白质 可调控遗传信息的表达 (调控序列),RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶,RNA聚合酶,RNA聚合酶,原核细胞的基因转录,真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 识别结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列,不能够编码蛋白质的序列,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,

2、内含子：,外显子：,非编码序列：,包括非编码区和内含子,基因工程又叫_通俗的来说，就是按照人们的意愿，把一种生物的_提取出来，加以_，然后放到_，定向的改造生物的_,一、基因工程的概念及原理,基因拼接技术或DNA重组技术,某种基因,修饰改造,另外一种生物的细胞中,遗传性状,抗虫棉的培育：,苏云金杆菌,Bt毒蛋白基因,毒蛋白,棉花细胞,杀死害虫,1.供体：提供_。 2.操作环境：_。 3.操作水平：_水平。 4.原理：_。 5.受体：表达目的基因。 6.本质：性状在_体内表达。 7.优点：克服_ _障碍，定向改 造生物_。,目的基因,体外,分子,基因重组,受体,远缘杂交不亲和,性状,对基因工程的

3、概念的理解,二、基因工程的工具,准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） 基因转移工具（“分子运输车”）,工具工具酶,限制性核酸内切酶（简称“限制酶”）,DNA连接酶,运载体,来源：,种类：,特点：,主要从原核生物中分离纯化而来,大约4000种，限制酶是一类酶，而不是一种酶,能够识别双链DNA分子的某种特定_，使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断开。,1、“分子手术刀” 限制酶,限制酶在原核生物中主要起切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自身的目的。,化学本质：,蛋白质,作用：,可用于目的基因和载体的切割,结果：,产生_或_。,黏性末端,平末端,磷

4、酸二酯键,核苷酸序列,G A A T T C,C T T A A G,黏性末端,黏性末端,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)能特异性识别_，并在_之间切开。,限制酶的作用,GAATTC序列,G和A,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,SmaI只能识别_，并在_之间切开。,CCCGGG序列,C和G,一GGATCC一 一CCTAGG一,一GATC 一 一 CTAG 一,限制酶I,限制酶,GAATTC CTTAAG,EcoR,同一种DNA片段用不同限制性酶处理，形成的黏性末端一般不相同，但也有相同的。,黏性末端相同,黏性末端不相同,作用：,两类,将_“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_

5、,这样一个重组的DNA分子就形成了。,2、分子缝合针DNA连接酶,双链 DNA片段,磷酸二酯键,种类：,(注：形成的是磷酸二酯键而不是氢键，无特异性),连接黏性末端和平末端,只能连接黏性末端,都能催化形成磷酸二酯键,形成重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键,在两DNA片段之间形成磷酸二酯键,3、基因的运输工具运载体,作用：,如果直接把外源基因导入细胞，外源基因在细胞中不能进行复制、转录和稳定保存。,常用的运载体分为两类：,a.质粒,b.噬菌体的衍生物、动植物病毒,(是拟核外能够自主复制

6、的小型环状DNA）,有侵染或进入宿主细胞的能力,作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去； 使外源基因能在受体细胞内稳定保存、复制和表达。,载体的化学本质:,能够自我复制的DNA分子,作为运载体必须具备哪些条件？,4)对受体细胞无害,5)大小合适,在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,1)能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2)一至多个限制酶切点 3)标记基因,便与外源基因连接,供重组DNA的鉴定和选择,(如抗菌素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等),二、基因工程基本操作过程,1、目的基因的获取,(一)目的基因的获取,1、目的基因主要是指 _也

7、可以是一些具有_。,编码蛋白质的结构基因,2、目前常用的获取方法：,人工合成法,反转录法,化学合成法,利用PCR技术扩增,从基因文库中获取,调控作用的因子,初始目的基因的来源,从自然界中已有物种中分离,人工合成,目的基因序列未知,目的基因序列已知,(1)从基因文库中获取目的基因,基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,基因库是指一个种群中全部个体所含有的全部基因。,含有一种生物的全部基因,只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。,种类,提取某

8、种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,-鸟枪法,基因组文库构建,包含了这种生物的所有基因,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,-鸟枪法,基因组文库构建,cDNA文库的构建,提取生物某发育时期mRNA,单链DNA,逆转录酶,双链的cDNA,与载体连接导入受体菌群储存起来,DNA聚合酶,只含该生物的部分基因,-逆转录法,基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可

9、以,部分基因可以,思考： 如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _ 、 _ 、 _,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA双链复制,已知基因的核苷酸序列（前提）,四种脱氧核苷酸,一对DNA引物,热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(2)利用PCR技术扩增目

10、的基因,根据已知目的基因的核苷酸序列来合成引物,模板DNA,第一步DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,氢键,单链DNA,过程：,模板DNA,第二步退火（复性55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,双链,模板DNA,模板DNA,第三步延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的DNA链。,模板DNA,模板DNA,PCR技术是分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图所示)。,(4)DNA的复制需要引物，其主要原因是_。引物的实质是_，若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在

11、缓冲溶液中至少加入_个引物。,DNA的复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3端延伸DNA链,单链RNA或者单链DNA分子,2112,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,原料、模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞内,热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）,DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用,目的基因 启动子 终止子 标记基因 复制原点,(位于基因的首端，RNA聚合酶识别和结合的部位),(位于基因的末端，使转录停止),鉴别和筛选受体细胞是否含有

12、目的基因，一般为抗性基因或荧光基因,(二）基因表达载体的构建基因工程的核心,表达载体的组成：,注意目的基因插入的位置，选择限制酶的种类,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,重组运载体,运载体自连,目的基因自连,AATTC G,G CTTAA,思考：形成的重组DNA分子中，由2个DNA片段之间连接形成的产物有哪些种类？,重组DNA,通常用两种不同的限制酶切割目的基因和运载体,原因：防止目的基因自身环化、运载体自我连接、运载体和目的基因反向连接，提高所需重组DNA的概率,限制酶的选择原则,(1)根据目的基因两端的限制酶切点,切点位于目的基因两端的限制酶,不能切基因内部,（2）根据质粒的特点确定限制酶

13、的种类,切割目的基因与质粒要具有相同的黏性末端 切割后具备标记基因、复制原点、启动子和终止子。 切割位点在启动子和终止子之间 质粒上标出TDNA片段，则所选限制酶切点应位于TDNA片段,若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是Bgl(AGATCT)、EcoR(GAATTC)、Sau3A(GATC)。下列分析合理的是(),A.用EcoR切割目的基因和P1噬菌体载体 B.用Bgl和EcoR切割目的基因和P1噬菌体载体 C.用Bgl和Sau3A切割目的基因和P1噬菌体载体 D.用EcoR和Sau3A切割目的基因和P1噬菌体载体,

14、D,（三）将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞,1)农杆菌转化法,对象、过程、原理 (课本P12),2)基因枪法,3)花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞,3、将目的基因导入微生物细胞,显微注射法 (步骤),Ca2+处理法（原理、步骤）,为什么大多用微生物作为受体细胞？,用原核生物和真核生物作为受体细胞的区别?,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,-转化,(四）目的基因的检测与鉴定,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道,分子水平检测,检测转基因生物的DNA是否插入目的基因(目的基因能否在受体细胞中稳定表

15、达的关键) 提取DNA，DNA分子杂交,检测目的基因是否转录出了mRNA 提取mRNA，分子杂交,检测目的基因是否翻译成蛋白质 提取蛋白质、抗原-抗体杂交,个体水平检测：检测性状,也可利用重组质粒上的抗性基因(标记基因)进行筛选,抗虫（抗病）接种实验,1.植物基因工程：主要用于提高农作物的_，以及改 良_和利用植物_等方面。 2.动物基因工程：主要应用于动物品种改良、建立_ _等方面。 3.基因工程药物：来源于转基因的_。 4.基因治疗：把_导入病人体内，使该基因的_ _发挥功能。,抗逆能力,农作物的品质,生产药物,生物反应器,器官移植,工程菌,正常基因,表达产物,基因工程的应用,体外基因治疗

16、,体内基因治疗,严重复合型免疫缺陷症,(腺苷酸脱氨酶基因),严重复合型免疫缺陷症,(腺苷酸脱氨酶基因),比较基因治疗与基因诊断：,基因表达,正常基因,碱基互补配对,DNA探针,将 基因与 等调控组件重组在一起，通过 等方法，导入哺乳动物的 中，将 其 送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。,乳腺生物反应器,乳腺生物反应器的优点： 产量高；质量好；成本低；易提取。,药物蛋白,乳腺蛋白基因的启动子,显微注射,受精卵,2、蛋白质工程的基本原理,基因 DNA,氨基酸序列 多肽链,蛋白质 三维结构,预期功能,生物功能,mRNA,转录,翻译,折叠,DNA合成,分子设计,蛋白质的功能是DNA决定的，要制造出新的蛋白质， 就要改造