临床常见苛养菌的培养与鉴定

1、临床常见苛养菌的鉴定与药敏,无锡市第二人民医院,第1页,苛养菌概述,苛养菌的基本特征： 对营养要求较高，在普通培养基上不生长或难以生长的一类细菌 体外培养需添加特殊因子或其他营养成分 2. 苛养菌分离和鉴定的基本要求： 采用 高营养 的培养基，延长培养时间 置于 CO2 或 微需氧 的环境，保持一定湿度 不能随意丢弃无法鉴定的细菌，极有可能是苛养菌及少见菌,第2页,目录,1.肺炎链球菌,2.流感嗜血杆菌,3. 脑膜炎奈瑟氏菌,4. 淋病奈瑟氏菌,5.布鲁氏菌属,6.放线菌属,第3页,7.星形诺卡菌,8.溶血隐秘杆菌,1.肺炎链球菌,第4页,1.1 肺炎链球菌-概述,第5页,肺炎链球菌社区感染常

2、见病原菌之一，定植在正常人的鼻咽部。 以肺部感染为主，大叶性肺炎多见。同时会导致耳部及鼻咽部的感染。严重时可继发胸膜炎、脓胸、脑膜炎和败血症。 常见送检标本类型有痰、咽拭子、尿液、脑脊液、血液、穿刺液 。 肺炎球菌离开人体后很易死亡，痰培养分离率很低。,易感人群：小于5岁及大于65岁,肺炎链球菌疫苗,1.2 肺炎链球菌-生物学性状,培养条件：CO2环境，哥伦比亚血平板。 菌落形态：18-24h后血平板上形成草绿色溶血、灰色、半透明、圆形、针尖样、表面光滑（有些菌株可表现为粘液状）的菌落;培养48h后，脐凹状菌落。 涂片染色：G+球菌,矛头状 ,成双或链状排列，尖端向外。,第6页,用放大镜观察,

3、1.2 肺炎链球菌-生物学性状,荚膜是肺炎链球菌的主要毒力因子之一。 根据荚膜特异性多糖抗原性，分为近90个血清型，成人致病以1-9型及12型最多，其中3型毒力最强，常致严重肺炎。 肺炎链球菌感染后，机体可建立较牢固的型特异性免疫，同型病菌的再次感染少见。,第7页,1.3 肺炎链球菌-检测方法,OP,Optochin试验: 敏感 胆汁溶菌试验: 阳性 菊糖发酵试验: 阳性 荚膜肿胀试验：阳性 触酶 ：阴性 胆汁七叶甘 ：阴性,甲型溶血链球菌(R),肺炎链球菌(S),第8页,干扰肺炎链球菌叶酸的合成,抑菌环直径14mm为敏感,抑菌环直径18mm 确认,Optochin试验,1.3 肺炎链球菌-检

4、测方法,第9页,标本类型：菌液,标本类型：尿液、脑脊液,科研,热点,1.4 肺炎链球菌-药敏分析,第10页,纸片扩散法检测药敏建议报告抗生素种类： 青霉素类：苯唑西林 大环内酯类：红霉素 磺胺类：复方新诺明 喹诺酮类：左氧 四环素类：四环素 糖肽类：万古霉素 增加使用D-抑菌圈试验或肉汤微量稀释法检测诱导型克林霉素耐药的信息。,诱导实验,新增,修订,纸片扩散法,1.4 肺炎链球菌-药敏分析,第11页,用苯唑西林代替青霉素来进行纸片扩散法检测,1.4 肺炎链球菌-药敏分析,第12页,PRSP的筛选 常规工作中可以用苯唑西林的纸片扩散法来检测青霉素的敏感性。,苯唑西林抑菌圈直径,20mm,19mm

5、,判定青霉素为敏感,可能是青霉素结果不可靠,必须测定青霉素的MIC,此法仅适用于无生命危险感染的患者。,预测-内酰胺类抗生素敏感,1.4 肺炎链球菌-药敏分析,第13页,-内酰胺类抗生素 K-B法未给出标准,推荐用MIC法,1.4 肺炎链球菌-药敏分析,第14页,E-test法,1.4 肺炎链球菌-药敏分析,第15页,脑膜炎分离株，需尽快用可靠方法检测和报告青霉素和头孢曲松(或头孢噻肟或美罗培南)的MIC值 对于非脑脊液标本中分离出的肺炎链球菌，需同时使用脑膜炎和非脑膜炎的折点来报告青霉素的敏感性,1.5 肺炎链球菌-案例分析,第16页,患者：男60岁，因“突发高热，颈强直，脑膜刺激征，意 识

6、不清住院”。 既往史：2008年脑科手术史，术后肺炎链球菌导致化脓性脑膜炎。 入院后： 脑脊液常规：白色，混，WBC:3.08*106 脑脊液涂片:革兰阳性球菌 脑脊液培养：草绿色溶血、灰色、圆形、针尖样、脐凹状菌落。Optochin试验: 敏感,胆汁溶菌试验: 阳性。 治疗过程：入院后经验用药：头孢曲松（广谱三代，容易透过血脑屏障） 获知涂片报告后，加万古霉素。两周后，预后较好。,2,3,1,4,5,2.流感嗜血杆菌,第17页,嗜血杆菌属（Haemophilus）,副流感 嗜血杆菌 H. parainfluenzae,溶血性 嗜血杆菌 H. paraphrophilus,副嗜沫 嗜血杆菌 H

7、. paraegyptius,嗜沫嗜血杆菌H. aphrophilus,杜克嗜血杆菌H. ducreyi,流感嗜血杆菌 H. influenzae,第18页,牙龈部定植,性病软下疳,呼吸道及全身感染,心内膜炎,亚急性心内膜炎,口咽部定植,2.1 流感嗜血杆菌-概述,第19页,呼吸道,继发感染,原发感染,鼻咽炎,喉头炎,急性气管炎,肺炎、中耳炎、 脑膜炎（2个月3岁） 心包炎、化脓性关节炎,菌血症,败血症,流感嗜血杆菌社区感染常见病原菌之一，常引起急性化脓性感染，有荚膜的b型强毒株可以通过呼吸道飞沫传播。 流感嗜血杆菌感染可分为原发性感染和继发感染。原发感染以小儿多见。继发感染：多是内源性感染，

8、以成人多见。 常见送检标本类型有痰、咽拭子、肺泡灌洗液、脑脊液、血液、穿刺液 。,2.2 流感嗜血杆菌-生物学性状,培养条件：需氧，CO2环境中，最适宜的培养基是巧克力平板（加入万古霉素和制霉菌素），不同嗜血杆菌对因子的需求不同。血平板上有卫星现象。 菌落形态：35，1824h培养形成微小、无色透明、不溶血，呈露滴样小菌落。 涂片染色：革兰阴性小杆菌，无芽胞。粘液型菌株有荚膜。,第20页,X因子 血红素 X因子为存在于血红蛋白中的一种血红素，为含铁的卟啉，耐高温，,V因子 辅酶或辅酶 血液中所含的V因子通常处于被抑制状态，经8090加热10min后可使V因子释放,2.3 流感嗜血杆菌-检测方法

9、,第21页,卫星试验 卟啉试验 糖发酵试验 吲哚快速法试验 尿素酶试验,2.3 流感嗜血杆菌-检测方法,金黄色葡萄球菌,卫星试验,X因子,V因子,V因子,血平板,MH平板,流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基上共同培养时可见卫星现象，因葡萄球菌能合成V因子，使其菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，远离者则较小。,2.3 流感嗜血杆菌-检测方法,第23页,MH平板,因子实验,黄色区域表示细菌生长,嗜血杆菌属根据吲哚、脲酶和鸟氨酸脱羧酶可分为8个生物型。,2.3 流感嗜血杆菌-检测方法,未定型为 无荚膜株,B定型为 有毒株,2.4 流感嗜血杆菌-药敏分析,第25页,仅用于流感,氨苄西林和阿莫

10、西林是治疗流感嗜血杆菌的首选药物。 -内酰胺酶的检测可作为一种快速试验方便地检出流感嗜血杆菌对氨苄西林和阿莫西林的耐药性,常用的检测方法为显色头孢菌素法-头孢硝噻吩法，我院目前阳性率在20%左右。 从脑脊液中分离的流感嗜血杆菌，常规中只报告氨苄西林、一种三代头孢菌素、氯霉素和美罗培南的试验结果。,3. 脑膜炎奈瑟氏菌,第26页,3.1 脑膜炎奈瑟氏菌-概述,第27页,脑膜炎奈瑟菌存在于携带者和脑膜炎患者的鼻咽部。 通过飞沫经空气传播，冬末春初为流行高峰。感染后多数患者呈携带状态或隐性感染。 少数出现呼吸道感染症状，仅极少数发展成败血症，累及脑膜，形成化脓性脑脊髓膜炎。 人工培养物如不及时转种，

11、超过48h常死亡。该菌能产生自溶酶，故采集时标本不宜放冰箱，应保温立即送检。 根据脑膜炎奈瑟菌夹膜多糖抗原的不同， 可分为A、B、C等13 个血清群，我国主要是由A群和C群引起。,3.2 脑膜炎奈瑟氏菌-生物学性状,培养条件：5%-10%的CO2 ,培养基：血平板和巧克力。 菌落形态：光滑、凸起、半透明、湿润。 涂片染色：革兰阴性球菌，肾形或咖啡豆状，凹面相对、成对排列位。脑脊液涂片时，常位于中性粒细胞内外。,第28页,3.3 脑膜炎奈瑟氏菌-鉴别要点,第29页,氧化酶实验： 阳性 触酶试验： 阳性 吲哚实验： 阴性 DNA酶： 阴性 硝酸盐还原实验：阴性 麦芽糖： 分解 淋病奈瑟菌的鉴别,与

12、不动杆菌的鉴别,葡萄糖： 分解 莫拉菌的鉴别,自动鉴定仪可上机检测,3.4 脑膜炎奈瑟氏菌-药敏分析,第30页,不必进行常规的药敏试验，临床耐药率不高。 临床经验性用药通常有：青霉素是首选，对氯霉素，广谱的头孢菌素敏感。 对临床细菌性脑膜炎经验治疗失败的细菌，都应该进行-内酰胺酶过筛和MIC试验,3.5 脑膜炎奈瑟氏菌-药敏分析,应该在生物安全柜中进行脑膜炎奈瑟菌的相关操作,3.5 脑膜炎奈瑟氏菌-案例分析,患者：男，足月出生九天，因无明显诱因出现发热,拟 “新生儿感染”收住入院儿科NICU。 入院后： 血常规：WBC10.01*09/L。脑脊液常规:无色透明，潘氏(+)，细胞计数0.3161

13、09/L。 血培养及脑脊液: 血培养阳性，脑脊液培养阴性。送至CDC确认为B群脑膜炎奈瑟菌。 咽拭子培养:3名密切接触者检出一株B群脑膜炎奈瑟菌株（系患者的外祖母）。 药敏试验：对头孢三嗪、 头孢噻肟、 利福平、 氨苄西林、四环素、 米诺霉素、环丙沙星均敏感；而对磺胺甲基异噁唑、复方新诺明均耐药。 治疗过程：予以独立病房隔离治疗，头孢曲松、青霉素抗感染及物理降温后，病情平稳。,3,2,1,4,4. 淋病奈瑟氏菌,第33页,4.1 淋病奈瑟氏菌-概述,第34页,淋病奈瑟菌侵入泌尿生殖系统繁殖，引起化脓性感染。胎儿可经产道感染造成新生儿淋病性急性结膜炎。 实验室在运送淋球菌培养及涂片标本时要注意保

14、温。 出现耐头孢菌素的淋病奈瑟菌是一个重大的公共卫生问题。 人是淋病奈瑟菌的唯一天然宿主。,4.2 淋病奈瑟氏菌-生物学性状,培养条件：5%-10%的CO2 ,培养基：改良Thayer-Martin(MTM)培养基（加入万古霉素、多粘菌素、制霉菌素、三甲氧苄二氨嘧啶TMP）。 菌落形态：灰白色、光滑、凸起、半透明。 涂片染色：革兰阴性球菌，肾形或咖啡豆状，凹面相对、成对排列位。涂片操作时不要用力涂擦，应该在玻片上滚动。,第35页,直接涂片报告方式为：找到革兰阴性双球菌（细胞内）,4.3 淋病奈瑟氏菌-鉴别要点,第36页,氧化酶实验： 阳性 触酶试验： 阳性 吲哚实验： 阴性 DNA酶： 阴性

15、硝酸盐还原实验：阴性 麦芽糖： 不分解,与不动杆菌的鉴别,葡萄糖： 分解,脑膜炎奈瑟菌的鉴别,莫拉菌的鉴别,4.4 淋病奈瑟氏菌药敏分析,第37页,2013年CLSI将头孢曲松、头孢克肟、环丙沙星和四环素从试验报告C组移到试验报告A组，并注明不需要进行常规试验， 根据疾病预防控制中心(CDC)指南推荐仅考虑用作治疗失败的备选 。, 不需要常规试验。,4.4 淋病奈瑟氏菌药敏分析,第38页,纸片扩散法测试淋病奈瑟菌，某种抗菌药物试验结果是“中介”，提示结果不可靠，需要重复试验,5.布鲁氏菌,第39页,5.1 布鲁氏菌-概述,布鲁菌是国家乙类传染病，动物源性疾病，引起变态反应性人畜共患病，实验室注

16、意生物防护。所有操作在生物安全柜，废弃物高压灭菌；结果上报疾控中心； 人感染后，主要表现为发热、发冷、全身痛和多汗，肝肿大，外周非侵蚀性关节炎等,反复发烧呈“波浪热”。先侵入淋巴再入血，症状极不典型容易误诊。 易感人群：畜牧业及皮革加工行业。 国内以羊型布鲁菌病最为多见，未经治疗者的自然病程为36个月。细胞内寄生菌。布鲁菌含有两种抗原物质：A抗原和M抗原。,第40页,5.2 布鲁氏菌-生物学性状,培养条件：CO2环境，哥伦比亚血平板专性需氧。 菌落形态：37培养在血琼脂平板培养5-7天可形成灰色不溶血菌落。在固体培养基上菌落为无色、半透明、圆形、表明光滑、边缘整齐。 涂片染色：革兰氏阴性短小球

17、杆菌，革兰染色经常着色不佳，易堆积，吉姆染色呈紫色。,第41页,5.3 布鲁氏菌-检测方法,第42页,血清学试验在国内外用于布鲁菌的诊断-疾控中心 感染病原菌后，2周后会产生抗体。常见的血清试验有虎红试验（RB）,血清凝集试验。,氧化酶阳性（+）、触酶阳性（+） 、 H2S阳性（+）,血培养报阳时间3-5天。 直接上机鉴定,转种延长时间 涂片,5.3 布鲁氏菌-检测方法,第43页,杨铭，汪定成,邵海连等，全自动血培养仪中布鲁菌阳性报警时间及其他病原菌的比较J.中国感染控制杂志2013,12（6）:451-453,5.4 布鲁氏菌-药敏分析,不推荐布鲁氏菌进行体外药敏试验。 利福平对本病有效，利

18、福平加四环素（多西环素），疗程6周，为世界卫生组织推荐的治疗方案。利福平是具有较强的胞内渗透作用。 羊、猪型感染者以四环素与链霉素合用为宜。,第44页,5.5 布鲁氏菌-药敏分析,患者：男，12岁，因“间断右髋关节痛月余”就诊。 病史：4月前开始发热，关节痛间断。患儿父亲为野味加工者，患儿有羊接触史。 入院后： 1. 进行血和骨髓培养，48h后血培养仪报警阳性，涂片革兰染色镜检为阴性短小球杆菌呈细沙样堆积。阳性瓶转种至血平板及巧克力平板，继续培养至 ，巧克力平板上可见无色、透明、湿润、细小菌落生长，血平板菌落更小。 2.初步生化反应氧化酶阳性，触酶阳性。 3.使用法国生物梅里埃VITEK-2

19、COMPACT鉴定系统，结果为羊布鲁菌。 4.血清凝集试验滴度1：800（1:100为阳性） 治疗过程：1.间断用头孢噻肟、头孢哌酮-舒巴坦治疗，未出现明显缓解。 2.利福平加四环素，疗程6周，体温下降，预后较好。,第45页,1,2,3,4,5,6,6.放线菌属,第46页,6.1 放线菌属-概述,放线菌属，介于细菌与丝状真菌之间又接近细菌的一类丝状原核生物。 放线菌属正常寄居在口腔、上呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道，为人体的正常菌群，内源性感染。 当机体抵抗力下降，口腔卫生不良、拔牙或口腔粘膜受损时，引起放线菌病。 肺部感染：症状和体征酷似肺结核。,第47页,病灶组织和瘘管的脓汁中，肉眼可见硫磺样

20、颗粒,6.2 放线菌属-生物学性状,培养条件：5%-10%的CO2 , 微需氧环境，厌氧培养可生长。培养基：血平板，沙保罗琼脂可生长。 菌落形态：在血平板上形成灰白色或淡黄色粗糙而不规则的菌落，不溶血。 涂片染色：革兰阳性，丝状或发丝状，常形成分枝状无隔菌丝 。 硫磺样颗粒压片，在镜下可见放射状排列的菌丝，形似菊花状。,第48页,6.3 放线菌属-检测方法,第49页,溶血(-) 葡萄糖(+) 甘露醇(+) 吲哚(-) 过氧化氢酶试验(-),6.4 放线菌属-药敏分析,临床常规不做药敏 羧苄西林，氯霉素，克林霉素和红霉素敏感 羧苄西林为首选药物,第50页,7.星型诺卡菌,第51页,7.1 星型诺卡菌-概述,诺卡菌属是广泛分布与土壤中的一群需氧性放线菌。易感人群：免疫力低下者,第52页,血行播散，引起脑膜炎与脑脓肿,侵入皮下组织引起慢性化脓性肉芽肿与瘘管形成,脑脊液，脓液，血,痰，肺泡灌洗液，穿刺液,脓液，组织,巴西诺卡菌,外源性感染,足分枝菌病,7.2 星型诺卡菌-生物学性状,培养条件：5%-10%的CO2，专性需氧菌 。 培养基：血平板及沙保培养基（一周）。 菌落