章十-微生物的分类和鉴定..ppt

1、微生物的分类和鉴定,微生物分类学定义：按微生物的亲缘关系和进化规律把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群的科学。 任务：分类、鉴定、命名,第一节通用分类单元,一、种以上的系统分类单元 界 Kingdom 门 Phylum（或Division）亚门 纲 Class 亚纲 超目 目 Order 亚目 科 Family 亚科 族 亚族 属 Genus 种 Species,必要时可添加“亚”、“超”、“族”,种的概念,种的定义：种是一个基本分类单位，是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有明显差异的菌株的总称。在微生物中，一个种只能用该种内的一个典型菌株作为具体标本，它就是该种

2、的模式种。 新种： sp.nov.或nov. sp.，新被鉴定的种，在以往权威性的分类、鉴定手册中从未记载过的微生物。发表时应在其学名后标上sp.nov.的符号，新种发表前应将其模式菌株的培养物应存放在一个永久性的保藏机构中，并应允许人们从中取得。,种的分类地位举例,二、微生物的学名,学名：菌种的科学名称。菌种的学名是按照国际细菌命名法规命名的国际学术界公认，并通用的名称。 命名原则： 学名=属名+种的加词+（首次定名人）+现名定名人和鲜明定名年份 规定与常识：属名应大写首字母、单数、可以组合外而成。种的加词代表一个种的次要特征，首字小写,(一)双名法,(二) 三名法,在少数情况下，当某种是一

3、个亚种（subspecies，简称“subsp”，排正体字）或变种*（variety，简称“var”，排正体字）时，学名就应按“三名法”构成。,(三)有关学名的其它知识,1.属名 2.种名加词 3.学名的发音,1.属名,2.种名加词,3.学名的发音,三、亚种以下的几个分类单元,（一）亚种 （二）变种 （三）型 （四）菌株 /品系/毒株,（一）亚种,是一种进一步细分种时所用的单元。一般指除了某一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征与模式种相同的种。命名方法按“三名法”,（二）变种,是亚种的同义词。不主张再用。,（三）型,作若干菌株变异型的后缀。,（四）菌株 /品系/毒株/株,任何由一个独立分离的单细

4、胞（或单个病毒）繁殖而成的遗传型上纯的群体及其后代叫菌株。 同一菌种的不同菌株间，主要性状相同，但一些生理生化性状却存在差异； 菌株是物种内遗传多样性的客观反映，其数目是无数的； 菌株与克隆概念相同； 某一菌株发生稳定变异的后代需要重新命名； 菌株的确定：实验室可以自己命名。 Escherichia coli K12, E.coli O-157：H7,亚种以下的分类单元,亚种（subspeciers）：种的进一步细分，一般指其某一民而稳定的特征与模式中不同的种常在种名、署名的加词后写上subsp.然后再写具体亚种的加词； 变种（ variety）：容易引起混乱； 型 form：使用中用型作为后

5、缀；表示细菌菌株，现已作废； 类群（group）：没有分类地位非正式地指定一组具有某些共同性状的生物； 菌株（strain）：表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯种群体极其一切后代；实际上是一个微生物达到遗传性纯的标志。 小种（race）：涵义较乱，在不同分支学科中由不同涵义； 相（phase）：自然界存在的微生物交互变异的一定阶段； 态（state）：通常指微生物的菌落变异状态。,一、生物的界级分类学说 二、三域学说及其发展,第二节微生物在自然界的地位,第二节微生物在自然界的地位,生物的界级分类学说：是在认识发展过程中存在的对生物分类的不同阶段的不同观点。 如：二界系统、三界系统、四界

6、系统、五界系统、六界系统和三原界系统 三原界系统是1978年由R.H.Whittaker和L.Margulis提出的。 所有生物存在一个共同祖先，由它分三条进化路线，就形成了三个原界：古细菌原界（Archaebacter）、真细菌原界、真核生物原界 提出了内共生学说，主要是Margulis的贡献,三原界系统示意图,一、生物的界级分类学说,1.二界系统 2.三界系统 3.五界系统,生物界级学说发展的示意图。阴影部分指微生物。,1. 二界系统：1753 Linnaeus,标准： 取食方式、光和作用、运动性、 细胞壁 动物界 植物界,2.三界系统：1866 Heackel,新物种的发现，如细菌有壁、

7、无光合作用 动物界 植物界 原生生物界原始或古老的生命形式、 单细胞及无核类,3.五界系统：1969 （Whittaker）,原生生物界 (Protista)：单细胞藻类、 原生动物、 粘菌 真菌界 (Fungi)：真菌、酵母菌 原核生物界 (Monera)：细菌、蓝细菌 植物界 (Plantae) 动物界（Animalia）,原核生物,真核单细胞生物,真核多细胞生物,光合营养,吸收式营养,摄食式营养,导管植物,绿藻门,苔藓植物,子囊菌门,担子菌门,接合菌门,粘菌,节肢动物,脊椎动物,肉足虫,孢子虫,甲藻,金藻门,细菌,蓝藻,原核生物界,原生生物界,动物界,真菌界,植物界,二、三域学说及其发展

8、 1980（Woese）,16sRNA共同的祖先 古细菌域：产甲烷细菌、极端嗜盐菌、极端嗜酸热菌 真细菌域：除古细菌原界以外的细菌 真核生物域：原生生物、真菌、动物、植物,嗜热菌,真细菌原界,紫色细菌,G+细菌,绿色非硫细菌,蓝细菌,黄杆菌,极端嗜盐菌,甲烷细菌,极端嗜酸热菌,动物,纤毛虫,真菌,植物,鞭毛虫,微孢虫,原始祖先 RNA?,真核原界,古细菌原界,内共生假说,现今一切生物都有一个共同的远祖进化而来。小细胞先分化出细菌和古生菌。古生菌分支上的细胞丧失细胞壁后，先后吞噬了变形细菌（相当于G-细菌）和蓝细菌，并形成了内共生，从而使两者进化成与宿主细胞难分难解的细胞器线粒体和叶绿体，于是宿

9、主最终也就发展成了各类真核生物。,三域学说及其生物进化谱系树,促使人们提出三原界学说的最重要原因是具有一系列独特性状的曾称作“第三生物”的古细菌的发现。与真细菌相比，古细菌有以下几个特点： （1）细胞膜的类脂特殊古细菌所含的类脂是不可皂化的。其中的中性类脂以类异戊二烯（isoprenoid）类的烃化物为主，极性类脂则以植烷甘油醚（phytanylglycerolethers）为主。 （2）细胞壁成分独特而多样有的以蛋白质为主，有的含杂多糖，有的类似于肽聚糖（“假肽聚糖”），但不论是何种成分，它们都不含胞壁酸、D型氨基酸和二氨基庚二酸。 （3）核糖体的16SrRNA其核苷酸顺序独特，既不同于真细

10、菌，也不同于真核生物。 （4）tRNA成分其核苷酸顺序也很特殊，且不存在胸腺嘧啶。 （5）蛋白质合成的起始密码始于甲硫氨酸，与真核生物相同。 （6）对抗生素等的敏感性对那些作用于真细菌细胞壁的抗生素如青霉素、头孢霉素和D-环丝氨酸等不敏感；对真细菌的转译有抑制作用的氯霉素不敏感；对真核生物的转译有抑制作用的白喉毒素却十分敏感。 （7）生态条件独特有的是严格厌氧菌，如产甲烷菌（metnanogens）；有的是极端嗜盐菌（extremehalophiles）；有的则是嗜热嗜酸菌,第三节 各大类微生物的分类系统纲要,一、Bergey 原核生物分类系统纲要 二、Ainsworth的真菌分类系统纲要,各

11、大类微生物的分类系统纲要,原核生物分类系统纲要伯杰氏系统细菌学手册 真菌界分类系统很多，各国采用不同的系统，比较混乱。近年来为较多人接受的是Ainsworth的纲要。,一、Bergey 原核生物分类系统纲要,伯杰氏鉴定细菌学手册 1st ed, 1923； 8th ed, 1974, 15个国家、130多位科学家参与撰写； 9th ed, 1994; 其不同版本代表了出版时的细菌分类的最新成果。70年代以来该书所提出的分类系统已被各国学术界普遍采纳。 大量的分子生物学资料的采用似的原核分类已从以往的以表型、实用性鉴定指标为主的旧体系向以遗传型为基础的系统进化分类新体系逐渐转变。,伯杰氏系统细菌

12、学手册 1st ed, 1984-1989, 分为4卷；是在伯杰氏鉴定细菌手册 8th ed 的基础之上增加了大量的分子生物学资料。但由于当时细菌系统发育的资料仍较零碎，所以有相当一部分类群未能科目级别分类，从实际需要出发，主要根据表型特征将整个原核生物分为33组，33个组的划分见表。国际上最为流行的版本。微生物分类技术和学术理论的发展促进了生物科学的进步。 2ed ed, 2000开始出版，分为5卷，提出完整的系统分类，将原核生物分为：古细菌界（2门、5组、8纲、11目、17科、63属、208种）；细菌界：（16门、26组、27纲、62目、163科、814属、4727种）；反映了人们对生物系

13、统发育的深刻认识。,二、Ainsworth等人的菌物分类系统纲要（用菌物代替以往的真菌） 目前广为接受Ainsworth第7版的分类系统及第八版,菌物界,Ainsworth等人的菌物分类系统纲要,第四节 微生物分类鉴定的方法,一、微生物分类鉴定的经典方法 二、微生物分类鉴定中的现代方法,微生物的鉴定,主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找权威性鉴定手册 鉴定方法分四个水平： 细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营养要求及生长条件等 细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、光合色素等的分析 蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等 基因或DNA水平：核酸分子杂交、

14、（G+C）mol%、转化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA核苷酸序列分析等,一、微生物分类鉴定的经典方法,（一）经典的鉴定指标 （二）微型、简便、快速、自动化鉴定技术,（一）经典鉴定指标,（二）微型、简便、快速、自动化鉴定技术,1.API细菌数值鉴定系统 2.Enterotube 系统 3.Biolog 全自动和手动细菌鉴定系统,1.API细菌数值鉴定系统,2.Enterotube 系统（肠管系统）,3.Biolog 全自动和手动细菌鉴定系统,全自动仪器和手动仪器鉴定,96孔的细菌培养板，其中95孔中各加有氧化还原指示剂和不同的发酵性碳源的培养基干粉，另一个孔为清水对照。鉴

15、定前先把待检纯种制成适当浓度的悬液，再吸入有八个头子的接种器中，接着用接种器按12下，即可接种完96孔菌液。在37下培养，把培养基平板放入检测室用分光光度计检测，再通过计算机系统最终确定该样品为何种微生物。,二、微生物分类鉴定中的现代方法,（一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型 （二）细胞化学成分用作鉴定指标 （三）数值分类法,（一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型,1.DNA碱基比例的测定 2.核酸分子杂交 3.rRNA寡核苷酸编目 4.微生物全基因组序列的测定,1.DNA碱基比例的测定,两个菌株G+Cmol值相差： 5%不同的种； 10%不同的属。,DNA碱基比例的测定即G+C%测定，是利用增色效

16、应测定Tm值，用Tm值确定某微生物DNA中的G+Cmol值。,2.核酸分子杂交,DNA-DNA 杂交法 DNA-rRNA 杂交法 rRNA-rRNA 杂交法 杂交同源性: 60%, 同种 70%, 同一亚种 20%-60%, 同一属,3.rRNA寡核苷酸编目分析,rRNA普遍存在,易于提取; rRNA重要恒定的生理功能; 在细胞中含量大，易于提取； 编码rRNA的基因在细胞中不像质粒DNA那样会转移，而是十分稳定的 ； rRNA的非常保守性-进化尺度; 16S/18S rRNA 核苷酸数量适中, 信息量大,易于分析。在原核生物核糖体所含的三种rRNA（23S，16S和5S，见图11-11）中，

17、其核苷酸数分别约为2900、1540和120个，其中的16SrRNA不但核苷酸数适中，而且信息量较大且易于分析，故是理想的研究材料。,分析生物细胞中rRNA寡核苷酸序列同源性，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。,选用rRNA做生物进化和系统分类的原因,原理： 水解rRNA，产生很多长短不一的寡核苷酸片段，电泳分离，放射自显影技术获得指纹图谱，确定不同长度寡核苷酸斑点在电泳谱上的位置，找出图谱中链长在6个核苷酸以上的寡核苷酸片段作序列分析，获得的结果进行按不同长度进行编目、列表。通过比较、分析、计算，就可知道各菌株间的亲缘关系大小。若两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其产生的寡核苷酸片

18、段的序列也越接近，反之亦然。,3.rRNA寡核苷酸编目分析,通过T1RNA酶的水解，一般可使rRNA形成含有120个核苷酸单位的寡核苷酸片段。如果形象地把只含一个核苷酸的片段称为“字母”的话，则含两个以上核苷酸的片段就成了“单词”。将含有6个“字母”以上的所有“单词”一一测定其核苷酸序列，最后可把它们编成一部“词典”。于是，两个茵株rRNA的相似性就可通过查阅“词典”来作比较。比较的具体方法是计算它们间的缔合系数（associatedcoefficient）或相关系数SAB值：,上式中，NAB是A、B两被测菌株所共同具有的“单词”的“字母”数，而NA和NB则是两株菌分别具有的“单词”的“字母”

19、数。根据SAB值进行数值分析，就可推知它们之间的亲缘关系。 它的作用很大，至今Woese及其同事已对400多株细菌和放线菌进行过分析，并从其中发现了生命的第三种形式古细菌，提出了生物界级分类中的“三域学说”,4.微生物基因组全序列的测定,正式公布: 53种 正在进行: 100种,（二）细胞化学成分用作鉴定指标,1.细胞壁化学成分 2.全细胞水解液的糖型 3.磷酸类脂分析 4.枝酸菌的分析 5.醌类的分析 6.气相色谱技术用于微生物鉴定,1.细胞壁化学成分,根据肽尾第3位氨基酸的种类、肽桥结构、肽桥交联的位置，肽聚糖可以分为5类。,第3位为内消旋的二氨基庚二酸（meso-DAP），,第3位为赖氨

20、酸（Lys），,第3位为L-DAP,第3位为L-鸟氨酸（L-Orn），,第3位氨基酸的种类不固定,2.全细胞水解液的糖型,以放线菌为例。它们的糖型可分四类,3.磷酸类脂分析,磷酸类脂是极性类脂，位于细菌、放线菌的细胞膜上。不同属放线菌其磷脂类组分有所不同，故分析这一成分是鉴别放线菌属的重要指标之一。 磷酸类脂的种类很多，其中有5种可用于作为鉴定指标：磷脂酰乙醇胺（PE）；磷脂酰甲基乙醇胺（PME）；磷脂酰胆碱（PC）；磷脂酰甘油（PG）；含葡萄糖胺未知结构的磷酸类脂（GluNu）。,4.枝酸菌的分析,枝菌酸（mycolicacid）存在于Nocardia、Mycobacterium和Coryn

21、ebacterium等属称作“诺卡氏菌形放线菌”中，它们是一些在形态上具有初生菌丝体，并多少呈规律性断裂成球状或杆状小体的一类放线菌。其形态结构简单，且细胞壁化学组分都为型，但它们所含的枝菌酸却差别明显，例如，分枝杆菌的枝菌酸（mycobactomycolicacid）约含80个碳原子，诺卡氏菌的枝菌酸（nocardomycolicacid）约含50个碳原子，而棒杆菌的枝菌酸（corynemycolicacid）则约含30个碳原子，因此，可分析其所含的枝菌酸来对它们分属。,5.醌类的分析,在细菌和放线菌中所含有的醌类物质主要可分两大类，即甲基萘醌（menaquinone，即维生素K）和泛醌（u

22、biquinone，即辅酶Q）。在它们的分子中各有长度为114个异戊烯单位不等的侧链，除了多烯侧链长度不同以外，多烯链的氢饱和度（或氢化度）也不同，这些特点就使醌的分析成为近年来放线菌分类鉴定上有相当重要价值的方法。 据研究，大多数细菌含有甲基萘醌、泛醌或两者均有，但革兰氏阳性细菌和放线菌只含有甲基萘醌。放线菌所含甲基萘醌的异戊烯侧链长度和氢饱和度都有较大的变化（810个异戊烯单位，一般为部分饱和）。,6.气相色谱技术用于微生物鉴定,气相色谱技术（gaschromatograph，GC）是一种新型的物理及物理化学分离分析方法，具有极高的选择性、分离效率、灵敏度和分析速度，为微生物细胞组分和代谢

23、产物的分析带来了较理想的分析方法，并由此产生了一门气相色谱化学分类学（gaschromatography-chemotaxonomy）。1963年，Able等首次通过细胞脂肪酸的分析来对细菌进行分类，同时，Oyama等又提出了用裂解气相色谱法（Pyrolysisgaschromatography，PGC，是一种热裂解法与色谱技术相结合的方法）来鉴定细菌。,（三）数值分类法,收集大量的数据，所有特征不分主次，采用计算机进行处理，计算两个菌株之间的相似系数，列出相似度矩阵，然后转换成树状谱。,数值分类法,即统计分类法，在200年前M. Adanson（17271806，法国植物学家）发表的分类原理基础上