地高辛 试剂盒说明书1

1、 仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用 只能在体外使用 地高辛dna标记和检测试剂盒1和nbt/bcip一起用于颜色检测通过酶联免疫法采用地高辛-dutp进行随机引物dna标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910此试剂盒储存条件-15oc-25oc此试剂盒可对10ng-3ugdna进行12次标记反应可检测100cm2面积的杂交膜24张指导手册2009.11版1前言1.1内容表1前言.21.1内容表.21.2试剂盒内容.32简介.52.1产品概述.53步骤和所需材料.83.1开始之前.83.2地高辛dna标记.93.3 标记效率的测定.113.4 dna 的转移和固定.143.

2、5杂交.163.6免疫检测.183.7 dna印记的洗脱和再杂交.204结果.214.1典型的结果.215附录.235.1故障排除.235.2引用.245.3订购信息.251.2 试剂盒内容瓶/杯号标签内容 包括功能1地高辛高效引物1. 50ul地高辛高效引物2. 5标记的混合物的浓度，包括随机引物，核苷酸，dig-dutp(碱标记的)，klenow酶和缓冲液混合的最佳浓度。3. 随时可用4. 澄清的粘液5. 用于dna的高效随机引物标记2dig标记的对照dna20ul（5ug/ml ）pbr328 dna（用bam hi 线性化）澄清溶液用于确定标记效率3dna稀释缓冲液31ml（50ug/

3、ml 鱼精dna在10mm tris-hc中，1mm edta ;在25ocph8.0 ）澄清溶液4抗地高辛的碱性磷酸酶结合物100ul（750u/ml）从羊，fab段，结合碱性磷酸酶中获取的澄清溶液5nbt/bcip61ml50浓度的原溶液（即67%（v/v）的dmso中含有18.75mg/ml硝基氯化四氮唑蓝和9.4mg/ml 5 -溴- 4 -氯-3-吲哚磷酸盐可以在浅黄色和棕色之间变化，澄清溶液与碱性磷酸酶反应6封闭液4100ml10浓度黄色，粘液7地高辛杂交颗粒准备4100ml（为17页做准备）杂交液附加仪器与所需试剂 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到

4、不同操作程序需要准备的设备概要。在每个操作程序的前面提供了详细的信息操作程序仪器设备试剂3.2 dig-dna标记水浴灭菌的双蒸水0.2m ph8.0 灭菌的edta3.3 标记效率的半定量测定带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封组缓冲液组合*te缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液te缓冲液3.4 dna转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备20ssc或者10ssc3.5 杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘3.6 免疫检测容器大小与滤器大小相适应杂交袋*地高辛洗涤和封组缓冲液组合*te缓冲液或者洗涤缓冲液

5、 马来酸缓冲液检测缓冲液te缓冲液3.8 dna 斑点的脱色和重新标记探针大的托盘水浴10ssc10%sds0.2m naoh*标记的产品可以从roche applied science 获得2 介绍2.1 产品概况实验原则 此试剂盒采用地高辛（dig），一种甾类半抗原， 去标记dna探针从而通过酶免疫分析法用于杂交和后续的颜色检测（1）步骤描述dna标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记的高效引物获得了地高辛标记的dna探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的产物混合物，其中，含有地高辛dutp，碱性标记（图2）和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先优化的5浓度反应缓冲液杂交根据

6、标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dutp能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交免疫检测杂交探针可以和抗地高辛的碱性磷酸酶结合物和fab段进行免疫检测，然后采用比色底物nbt/bcip可以看到杂交结果。应用 地高辛标记dna探针可以用于： 所有类型的滤膜杂交 总基因组dna中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行 检测，如人，大麦和小麦。样品材料 至少100bp的dna片段 线性的质粒，cos质粒或者dna 超螺旋的dna实验时间 此表格列出了每一步实验所需的反应时间步骤反应时间dna标

7、记1小时-o/n杂交6小时或者o/n免疫检测1.5小时显色0.5-16小时检测数量 一个试剂盒足够用于： 不超过3ug的模板dna的12个标准的标记反应 和100cm2有24个斑点的检测质量控制根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品dna（pbr328）进行标记，0.1pg同源dna 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源dna可以通过1小时的显色进行检测）。试剂盒的储存和稳定性 未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15oc到-25oc（保质期印在标签上）。在干冰中运输 一旦开封，请根据下表达选择适宜的储存条件。 试剂盒成分储存条件抗地高辛碱性磷酸酶结合物（4号管cap）2-8oc

8、 稳定封组液（6号管bottle）未开封时 15oc-25oc 稳定一旦开封，应分装并储存在-15oc到-25oc 或者无菌条件下2-8oc间可以保存1个月。工作溶液都应是新鲜配制的nbt/bcip(6号管cap)2-8oc，稳定或者在15-25oc，至少4周注意：在干冰中运输过程中，温度迅速升到37oc时，物质容易溶解从而导致沉淀产生灵敏度和特异性 采用southern 杂交从1ug消化胎盘dna中检测到单拷贝人基因注意：灵敏度同时依据在杂交中标记的dna浓度和颜色反应的时间优点 此表描述了这个试剂盒的优点和特征优点特征精确，快速预先已混好的地高辛高效引物混合物减少了标记dna时手动操作的时

9、间，同时提高了产量，重复性好灵敏在复杂的整个的人dna及植物基因组中能够检测到单拷贝基因省时地高辛标记的探针可以至少储存一年。杂交溶液可以重复利用3-5次，重复次数主要取决于每次杂交中产生信号的标记探针的量3 实验步骤和所需材料3.1 在你开始前 主要的操作要求 此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示要求指引在清洁的条件下进行操作高效灭菌地高辛系统的试剂过滤灭菌的溶液包括：sds，吐温20，并应该加入到已灭菌的溶液中用干净的孵育托盘每次使用前都要严格地清洗实验托盘处理膜的要求带无粉手套处理膜的时候，只能用干净的镊子夹膜的边缘流程图3.2部分地高辛标记dna3.3部分标记效率的检测3.4部分d

10、na固定3.5部分杂交3.6部分免疫检测3.7部分dna斑点的洗脱与重新标记探针3.2 地高辛标记dna介绍随机引物标记的dna带有地高辛-11-dutp，这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，5乘浓度标记的混合物，其中，dntp混合物包括碱性标记的地高辛-11-dutp，标记级的klenow酶和适合的反应缓冲液。 附加设备和所需试剂 水浴 冰水混合物此表中列出了成分你，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途溶液成分储存条件/稳定性用途水高压灭菌的双蒸水15-25 oc，稳定稀释dnaedta0.2m edta ph8.015-25 oc，稳定终止标记反应模板dna 下

11、表中列出了模板dna所需特征： 特征详细信息纯度质粒dna采用高纯质粒提取试剂盒进行净化。当采用其他商业化的纯化试剂盒进行纯化时，我们建议额外进行一次苯酚/氯仿抽提以去除残余的蛋白质。在标记之前如果对模板进行限制酶切或者其他酶的修饰作用，那么此步骤也是需要进行的。大小为了获得理想的结果，模板dna应该线性化，且大小应该在100或者以上。如果模板dna大于5kb，那么在标记之前应该采用限制性酶切序列为4个核苷酸的限制性酶（如hae ）对模板进行酶解数量根据上面步骤的描述，原则上10ng-3g的模板均可以标记上，然而请仔细查看在给定的表中，用于你的杂交实验所需的探针的数量。可以根据提供的操作方法放

12、大总体积和成分用量来获得更大量的标记探针。如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，需标记的模板dna用量至少300ng（探针浓度：25ng/ml 杂交液）。标记从琼脂糖凝胶上分离的dna如果你想要完成基因组的southern 杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板dna从载体上分离出来。 从凝胶中分离dna片段，为获得更好的结果，可以用高效的pcr产物纯化试剂盒或者用琼脂糖凝胶dna提取试剂盒来从凝胶中分离dna。步骤此步骤用于标记10ng-3g dna 。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的dna（最高达10g）。步骤操作1向一个反应管中加入1g模板dna（线性或超螺旋）和高压灭菌的双

13、蒸水，终体积达16l。2沸水浴10分钟以变性dna，然后迅速插入冰水混合物中注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的3完全混合地高辛高效引物（瓶1），加入4l到变性的dna中，混合并短暂离心37孵育1小时或者过夜注意：较长的孵育时间（最高达20小时）能够提高地高辛标记dna的产量4加入2l 0.2m edta(ph8.0) 和/或 65加热10分钟终止反应注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从200bp到1000bp甚至更长，这主要取决于原始模板的长度标记反应的产量表1：此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每个实验采用1g dna 作为模板。

14、1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8g新合成的地高辛标记dna中。20小时后消耗了大约38%约2g的核苷酸。模板dna1h20h 10 ng45 ng600ng30 ng130 ng1050 ng100 ng270 ng1500ng300 ng450 ng2000ng1000 ng850 ng2300ng3000 ng1350 ng2650ng使用地高辛高效引物溶液，增加不同模板dna的量进行反应，并检测反应1小时和反应20小时的差异。地高辛标记dna的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实 （10个独立标记实验的平均值）。3.4 标记效率的确定介绍地高辛标记dna产量的确

15、定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。实验原则检测标记探针质量的好方法是直接检测法。步骤描述1将地高辛标记dna的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上；尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照dna（vial 2）作为标准。2采用anti-dig-ap结合物(vial 4)和随时即用的nbt/bcip(vial 5)对尼龙膜进行免疫检测。比较地高辛标记dna与对照dna的一系列稀释点的强度。所需附加溶液的制备请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，dna

16、酶和rna酶系列产品中获得。请注意：这些溶液也用于3.6中的检测步骤，可大批量准备溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1m马来酸0.15m naclph 7.5(20)0.3% (v/v)tween 2015-25,稳定去除未结合的抗体马来酸缓冲液0.1m马来酸0.15m nacl用naoh(固体)调节ph值到7.5(20)15-25,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1m tris-hcl0.1m naclph 9.5(20)15-25,稳定调整ph值到9.5te缓冲液10mm tris-hcl1 mm edtaph 8.015-25,稳定终止颜色反应试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒

17、工作溶液的制备方法：溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液按照1：10的比例将10封阻液（vial 6）稀释成1工作溶液现配现用封阻膜上非特异结合位点抗体溶液每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-ap(4号管)10000rpm离心5分钟。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：5000（150mu/ml）的比例稀释anti-digoxigenin-ap2-8，12h与地高辛标记的探针结合底物显色液取40l nbt/bcip(5号管)于2ml检测缓冲液中混匀注意：避光保存现配现用抗体结合的可视化稀释系列根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的

18、探针和地高辛标记的对照dna（vial 2）应该稀释到1ng/l。利用第3.2章中图表1可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记dna的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。注意：表1中给出的产量是采用高纯度的dna模板在最佳条件下生产出的。按照下表中的描述对你标记的探针和你的对照dna进行一系列的梯度稀释。管dna(l)来自于管#dna 稀释缓冲液（3号管）(l)稀释比例终浓度1稀释的原液1ng/l2514951：10010pg/l3152351：3.33pg/l452451：101pg/l553451：100.3 pg/l654451：100.1 pg/l755451：100.03

19、pg/l856451：100.01 pg/l90-50-0操作步骤下面的步骤描述的是直接检测。注意：在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜。步骤操作1分别从你标记的探针和标记对照dna的2-9号管中取出1 l点在尼龙膜上2通过紫外交联或者120烘烤30分钟的方法将核酸固定在膜上3将膜转移到一个装有20ml 马来酸缓冲液的塑料容器中在15-25中振荡孵育2分钟4在10ml 封阻液中孵育30分钟5在10ml 抗体溶液中孵育30分钟6用10ml洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟7在10ml检测缓冲液中平衡2-5分钟8将孵育膜放入盛有准备好的2ml底物显色液的盒子中，避光。在显色过程中不能摇动。注

20、意：几分钟后沉淀颜色开始形成，短时间内可适当打开盒子观察染色情况9当得到预期的斑点或者聚焦强度已经完成，则停止反应，用无菌双蒸水50ml或者te缓冲液洗膜5min结果可以用影印湿过滤器或者摄影记录结果分析比较对照与你的标记反应产生的点的强度差异，并计算出地高辛标记dna的量。如果你的探针稀释后量达0.1pg的点与对照dna的点均可见，那么说明标记的探针达到了预期的标记效率，能够满足杂交所需的探针浓度。孵育时间现象5-10分钟30pg斑点30分钟3pg斑点3.4 dna的转移和固定转移方法和膜凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中sambrook等的文章。胶中不加入eb会更好，因

21、为eb可能引起背景不均匀的问题。所有普通类型的dna转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验（4,5）；在实验中，在20ssc中采用毛细管转移的方法将dna转移到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。注意：碱性转移（如在0.4m naoh中）不适用于地高辛分子量的标记的转移。固定操作将dna固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：如果你想采用那么紫外交联的方法（尼龙膜）将膜放到已经用10ssc 浸透的whatman 3mm滤纸上。洗涤之前用紫外交联这块湿润的膜紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，然后自然晾干。120，烘烤（尼龙膜）在2ssc中洗涤一下膜将尼龙膜放在120下烘烤30分钟或者根据

22、操作说明的要求进行操作。80，烘烤（尼龙膜）在2ssc中洗涤一下膜将尼龙膜放在80下真空烘烤2小时膜的储存请根据下表选择膜的储存方法。如果那么你想继续实验立即将这个膜进行预杂交如果你想稍后进行实验那么将干燥的膜储存于2-83.5 杂交需要的附加设备 冰水浴 震荡水浴 或杂交炉 耐高温的塑料或者玻璃盒，培养皿，滚筒瓶或者可密封的塑料袋注意：不要用敞口的容器盛放地高辛杂交缓冲液杂交工作溶液的制备 分两次小心的将64ml无菌双蒸水加入地高辛杂交颗粒（7号瓶）中，然后，立即在37oc条件下搅拌5分钟进行溶解。杂交温度 适宜的杂交温度是根据gc含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下：

23、tm =49.82+0.41(%g+c)-(600/i) i=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算 topt.= tm -（2025） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度topt. 要比计算出的tm低20-25。topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低topt（大约每1%的错配要降低1.4），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高ssc浓度和降低洗涤温度）。操作步骤 请参照下表进行实验。步骤操作1将适量体积的杂交缓冲液（di

24、g easy hyb）提前预热到杂交温度（37-42）。在适当的容器中温和振荡30分钟进行预杂交。注意：膜应该自由的移动。尤其是如果你在同一个预杂交溶液中放入几张膜。2变性地高辛标记的dna探针：（在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/ml）将探针放入沸水浴中煮5分钟后快速放入冰水混合物中冷却。注意：因为dig-11-dutp 是碱标记的，因此dna 探针不能用碱处理（naoh）的方法变性。3将变性的地高辛标记探针加入到预热的地高辛杂交缓冲液（每100cm2 的膜加入3.5ml杂交缓冲液）中，充分混合但要避免产生泡沫（气泡容易产生背景）4倒出预杂交液，向膜上加入探针杂交液的混合物；温和振荡孵育4

25、小时或延长孵育至过夜杂交液的储存含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15到-25，可以反复使用几次，在每次使用前需要68新鲜变性10分钟。注意：不可以将杂交液煮沸。严谨洗涤对于大部分dna:dna应用,用0.5ssc进行严谨洗涤已经足够。针对每个探针来说，正确的洗涤条件应该依据经验来确定。对于人基因组dna，采用的条件是0.5ssc，65。探针长度大于150bp且gc含量高时，应在68下进行洗涤。对于长度为100bp或更短的探针，洗涤温度应该降低。此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。步骤操作1在15-25，用足够的2ssc，0.1%sds连续振荡洗涤2-5分钟。2在65-68，用足够的0

26、.5ssc，0.1%sds（提前预热到洗涤温度）连续振荡洗涤2-15分钟。3.6 免疫检测需要附加的试剂 请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，dna酶和rna酶系列产品中获得。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1m马来酸0.15m naclph 7.5(20)0.3% (v/v)tween 2015-25,稳定去除未结合的抗体（膜的洗涤）马来酸缓冲液0.1m马来酸0.15m nacl用naoh(固体)调节ph值到7.5(20)15-25,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1m tris-hcl0.1m naclph 9.5(20)15-25,稳定调整ph值到9.5（碱性磷酸酶的缓冲液）te缓冲液10mm tris-hcl1 mm edtaph 8.015-25,稳定终止颜色反应试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液按照1：10的比例将10封阻液（6号瓶按体积比10%溶解）稀释成1工作溶液现配现用封阻膜上非特异结合位点抗体溶液每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-ap(4号管)10000rpm离心5分钟。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：5000（150mu/ml）的