结核病细菌学检验#相关知识

1、结核病细菌学检验一、目的和任务 结核病人的细菌学检查，是发现传染源的最主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。因此，结核病细菌学检查是国家结核病控制规划(NTP)的重要组成部分，在结核病防治工作中起着不可缺少的重要作用。二、实验室的职能 为落实国家结核病控制规划中对结核病传染源监控要求，应建立各级结核病细菌学实验室，明确其职能和工作范围。各级结核病细菌学参比实验室(简称参比实验室)，应明确为各自辖区的结核病控制工作服务的宗旨。 (一)国家结核病参比实验室 在卫生部结核病控制中心领导下，国家结核病参比实验室负责全国结核病细菌学工作的规划 ，实施

2、等技术管理，并向中心报告工作。国家结核病参比实验室，应保持适当数量和结构的人员编制：专业人员1520人，其中高级专业技术职称3名以上，中级10名，初级7名。参比实验室的职能：1根据国家结核病控制规划的要求，规划全国结核病细菌学工作，制定实施措施，对全国结核病细菌学监控质量进行督导和评估。国家结核病参比实验室负有指导、协调、督导各 省(市、自治区)参比实验室的工作。2建立结核病细菌学实验技术标准化准则、操作规 程及规章制度。推行WHO推荐的国际通用的结核病细菌学检查技术。3建立可行的涂片镜 检、分离培养、药物敏感性试验的质量控制标准和质量控制系统。4承担非结核分支杆 菌菌种的最后鉴定，和其它非常

3、规分析手段的实施。5建立结核分支杆菌和非结核分支 杆菌临床菌株库网。制定库网的管理、交流和资源提供办法。6开展结核病细菌学 等实验诊断新技术，新方法的基础研究，及其实际应用可行性评估。7对我国结核病控制的实施性研究，提供细菌学服务。此外，对常规结核病 细菌学检查方法进行实施性研究。8培训省(市、自治区)或地、市参比室技术人员。 (二)省(市、自治区)参比实验室 省级参比实验室，是我国结核病控制规划细菌学监测中的重要环节。在省结核病防治所(科)的领导和国家结核病参比实验室的指导下，负责所在辖区结核病细菌学工作计划的制定和实施等技术管理。省级参比实验室，应有510名专业人员，其中含中、高级专业技术

4、职称人员2名以上。省级参比实验室，至少具有50平方米以上的实验工作场所。具备开展检查项目的相应仪器和设备，包括：生物安全柜一台、高压蒸汽灭菌锅一台、培养基蒸汽凝固灭菌器一台、恒温培养箱和双目生物光学显微镜均不少于两台、荧光显微镜一台、离心机一台、冰箱12台。 已建立菌株分库的省参比室，应有-20或-80冷冻箱。参比实验室的职能：1根据国家和省结核病控制规划的需要，规划本省结核病细菌学工作，制定实施措施。协调省内各级细菌实验室工作，对地、县结核病细菌学质量，进行监控、督导和评估。2开展涂片镜检、分离培养、药物敏感性检测和临床分离株种的初步鉴定。有条件的省参比实验室，可建立完整的分支杆菌菌种鉴定体

5、系，所有细菌学检查应严格遵照国家参比实验 室制定的标准化准则、操作规程及规章制度进行。3根据国家参比实验室制定的质控标准，对全省痰片镜检和分离培养工作进行质量控制。为地、市参比实验室开展分离培养，提供培养基服务。核准地、市实验室自制培养基。 4承担药物敏感性测定，接受国家参比实验室和跨国参比实验室，定期药物敏感性测定质量控制。5省临床分离野生株菌库，应参加全国菌株库网，遵守菌库的管理、交流和资源提供办法 。6为省结核病控制规划有关研究工作，提供细菌学服务。7将省结核病细菌学监测工作、质量控制年报表上报国家参比实验室。(三)地(市)级细菌学实验室 在省参比实验室的指导下，地(市)级细菌学实验室负

6、责本地(市)结核病细菌学监测。应有相应的专用工作场所和不少于4名专业人员。应能开展痰涂片镜检工作，并具有相应的仪器设备，包括：无菌柜、双目光学显微镜(备油镜镜头)、蒸汽高压灭菌锅、紫外线灭菌灯 、冰箱、离心机及染片所需的器材。实验室职能：1在省参比实验室的指导下，制定本地(市)结核病细菌学检测工作计划。2依照国家参比室制定的操作规程，开展痰直接涂片镜检工作。为县(市)结核病细菌学实验室提供抗酸染色液。3依照国家参比实验室制定的操作规程，为各县(市)提供分离培养服务。其培养基或由省参比实验室供给，或经省参比实验室核准后自制。 4定期督导和评价县(市)细菌学实验室的结核病细菌学检查工作，定期向省参

7、比实验室报告其督导、评价结果和质控报表。5定期培训所辖县(市)细菌学实验室技术人员。监督辖区内细菌学检验人员培训后上岗制度。 (四)县(市)级细菌学实验室 在省、地(市)参比实验室指导下，负责全县(市)结核病细菌学工作。应有1名以上专职工作人员，开展直接痰涂片镜检工作。应具有单独的涂片检查工作室，配备相应的仪器设备，包括双目光学显微镜(备油镜镜头)、蒸汽高压灭菌锅、紫外线灭菌灯、冰箱及染片所需的器材。县(市)实验室职能：1在省、地(市)参比实验室的指导下，制定本县(市)结核病细菌学检测的工作计划。2接受省、地(市)参比实验室的定期培训。痰检人员应在培训后上岗，并保持稳定。3按照国家参比室制定的

8、操作规程，开展痰直接涂片镜检工作。4应用统一的结核病细菌学实验室登记本，记录痰涂片镜检结果。5保存3个月的全部痰涂片，留待上级实验室复验质控后方可销毁。6运送需作分离培养的标本至上级实验室待检。7条件具备的县(市)实验室，经省参比实验室核准后，依照国家参比实验室制定的操作规程进行分离培养工作。并从省/地(市)参比实验室获得分离培养基。 8接受省参比实验室的定期质控检查。 (五)乡镇卫生院镜检站 在一些远离县(市)结防所、交通不便的乡镇，可选择乡镇中心卫生院建立涂片镜检站，镜检人员需经地(市)或县(市)实验室培训后方可上岗，人员保持稳定，接受定期复训。其涂片应全部保存，每13月由县(市)实验室负

9、责人复验一次。三、实验室人员培训 (一)国家参比实验室 1国家结核病参比实验室，每年召开省参比实验室负责人会议一次：报告工作，交流经验，研究和讨论工作中出现的问题及解决办法。2结合工作会议，每二年举办一次结核病细菌学研讨会，介绍有关结核病细菌学流行病学和实验室检测的新理论、新技术和新方法。3举办省级参比实验室专题培训。4接受省、地(市)实验人员的进修。(二)省级参比实验室 每年至少轮流培训下辖地(市)细菌实验室人员一次。培训可扩展至县(市)专业人员，或安排地(市)实验室对县(市)专业人员的培训。培训内容包括： 1结核病流行病概念和我国及本省结核病流行现状和问题。2国家结核病控制规划的原则。3结

10、核病细菌学检查在国家结核病控制规划中的作用。4痰涂片检查的规范，包括细菌实验室的安全、显微镜使用和保养、涂片的制作，染色液的制备、染色和镜检操作，正确的记录、报告方法等。5痰涂片镜检，分离培养的质量控制和报告方式。6结核病细菌学检验工作督导、访视技术，督导报告及要求。 (三)地(市)细菌学实验室 地(市)实验室应按省参比实验室的安排，结合痰片镜检和分离培养质量控制，每年对县级实验室专业人员进行培训。 县(市)新任痰检人员，需经不少于两周的技术培训，方可上岗。四、痰标本收集和送检的有关规定 (一)对象 1因症求诊者检查：凡因肺结核症状求诊者及转诊的可疑肺结核病人，均应送痰标本作涂片镜检(详见第三

11、章肺结核病人发现，第17页)。2疗效考核：凡已确诊、登记、治疗的肺结核病人，在化疗期间应按规定定期作痰菌复查 ：1)初治涂阳病人在疗程满2、5、6月时，复治涂阳病人在疗程满2、5、8月时，各查痰一次。 2)初、复治涂阳病人在疗程满2月时，痰菌仍为阳性者，应在治疗满3月时增加查痰一次。复治涂阳病人若满5个月治疗时痰菌仍阳性，应在满7个月时增加查痰一次。3)确诊、登记的涂阴肺结核病人，即使病人因故未接受治疗，也应在登记后满2和6月时进行痰菌检查。 (二)要求 1初诊病人应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)。如无夜间痰，在留取清 晨痰后23小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。疗程中

12、或复诊随访病人 按期每次送检两份痰(晨痰和夜间痰)。2痰标本采集：即时痰为病人就诊时咳出的痰液。清晨痰为清晨深咳出的痰液。夜间痰为就诊前夜间咳出的痰液。痰标本应以脓样、干酪样或脓性粘液样性质的痰液为合格标本，痰量应为35毫升。应由检验人员或专人验收痰标本，痰液不合格者，要求重新送检。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以供分析结果时参考。痰标本的容器，应采用国家参比实验室推荐的国际通用痰瓶，或采用直径4厘米、高2厘米的塑料或涂蜡纸密闭盒。留痰容器上应注明病人姓名、编号(门诊序号，或病人登记号)及日期 。3痰标本的保存和输送：痰标本容器密封，勿倒置，严防痰液外溢。不能立即作

13、分离培养的痰标本，须置4冰箱保存，防止痰液干涸或污染。需送上一级细菌实验室培养的痰标本，外送前应认真核对痰标本容器上标注，是否正确和清 晰 ，是否与化验单一致。痰容器应采用专用的结核杆菌和痰标本冰盒运送，或以纸张和塑料袋 封装、扎牢，顺序放置于包装袋内。盒外注明勿倒置标志。4送检时，县(市、区)结防所(科)医师应填写检验单。填写项目包括：病人姓名、地址、登记号(或门诊序号)、送检日期(或初诊日期)、送检原因(初诊病人或随访病人)。检验单应与痰标本分别放置在不同容器中，一齐送交上级实验室。5收到痰标本后，实验室检验人员仔细核对标本和检验单各项内容，察看痰标本是否合格。随后按顺序编号，及时检查和登

14、记。对不合格标本要求重送。 填写说明：1)实验序号：初诊病人的3份标本，及其后每次检查的痰标本，均用同一实验序号编号。2)痰标本来源：初诊病人门诊序号以门诊登记本为据；随访病人登记号 以病人登记本为据。3)痰标本性质，按脓样痰、干酪样痰、血性样痰、脓性粘液痰和水样痰分类登记。 6废弃标本和污染物的处理：1)痰盒和废弃标本等污染物，均须经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。2)痰盒等污染物如采用焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚化不彻底，或暴露焚烧是有害的。3)痰检工作面的消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，在操作厨中进行痰涂片操作。 涂片操作完成后，将盘与废弃物等一并进行高压蒸汽

15、灭菌，或与操作台面同时以3%石碳酸或其它可靠的消毒液擦拭后，再以紫外线灭菌灯(距离1米)照射30分钟。五、痰直接涂片检查法 (一)涂片 取经95%乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻璃片，于玻片背面的左端1/3 处以蓝色或黑色记号笔(玻璃铅笔)编号。用接种环或折断的竹签茬端，挑取痰标本的脓样、干酪样部分约0050.1ml，于玻片正面的右侧三分之二处均匀涂沫成225厘米卵圆形痰膜。自然干燥后待检。一张玻片只可涂沫一份标本。玻片只应使用一次，不得清洗后再次使用。(二)萋尔-尼尔逊氏染色法(Ziehl-Neelsen) 简称萋尼氏染色法：1试剂：1)碱性复红乙醇染色储存液：碱性复红液：8

16、克碱性复红溶于95%乙醇100毫升中。5%石碳酸水溶液：5克石碳酸溶于100毫升蒸馏水中。2)碱性复红乙醇染色液：10毫升碱性复红储存液与90毫升5%石碳酸水溶液混合。3)5%盐酸乙醇脱色液：5毫升浓盐酸与95毫升95%乙醇混合。4)0.3%亚甲兰复染储存液：0.3克亚甲兰溶于50毫升95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100毫升。5)亚甲兰复染液：以蒸馏水10倍稀释0.3%亚甲兰复染储存液即得亚甲兰复染液。2染色步骤：1)火焰固定涂片。2)滴加碱性复红乙醇染色液，盖满痰膜。小心火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色三分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。切勿使染

17、色液沸腾。 3)流水自玻片背面上端轻洗，洗清染色液。4)自痰膜上端外缘滴加脱色液，流过痰膜。需脱至痰膜无可视红色为止。脱色应单片进行。 5)流水自玻片背面上端轻洗，去脱色液。6)滴加亚甲兰复染液，染色30秒钟。7)流水自玻片背面上端轻洗，去复染液。8)待干后镜检。3镜检与报告：光学显微镜镜检(目镜10X，油镜100X)染色痰片。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。按照下列标准报告所得结果：1)抗酸杆菌阴性： 连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。2)抗酸杆菌可疑()：12条抗酸杆菌/300视野。3)抗酸杆菌阳性(1+)：39条抗酸杆菌/100视野。4)抗酸杆菌阳性(2+)

18、：19条抗酸杆菌/10视野。5)抗酸杆菌阳性(3+)：19条抗酸杆菌/每个视野。6)抗酸杆菌阳性(4+)：10条抗酸杆菌/每视野。镜检结果，应及时记录在结核病细菌学实验室登记本和化验报告单上。痰涂片化验单应包括痰标本的性状。阴性结果应填记阴性不得以(-)表达。300个视野内仅见12条 抗酸杆菌者，应在报告单上注明条数，医生可结合胸片进行判断。必要时再取标本复查证实 ，仍见12条抗酸杆菌/300个视野，该病例可确诊为涂阳病人。标本应在送检48小时内报告结果。六、痰培养检查法 (一)痰标本采集 新发病人应在抗结核药物治疗前留取痰标本。治疗中的病人应停药23天后留取痰标本。病人于清晨漱口后，咳痰35

19、毫升留作培养检查。如需送上级实验室检查，应在标准痰瓶中，加入与标本等体积的防腐液06%溴化十六烷基吡啶(CPB)的2%氯化钠(NaCl)液，密封保存。此标本应及时送交上级实验室。防腐处理后，痰标本可在室温下短期存放。但仍以4保存为宜，存放时间不应超过2周。 (二)分离培养基 分离培养采用酸性罗氏培养基和丙酮酸钠培养基。1酸性改良罗氏培养基：成份：基础液 谷氨酸钠(纯度99%以上) WB7.2克磷酸二氢钾 14.0克硫酸镁0.24克柠檬酸镁 0.6克丙三醇 12毫升蒸馏水 600毫升无机盐试剂应采用化学纯(CP)试剂新鲜鸡卵液 1000毫升2%孔雀绿水溶液 20毫升制备方法：1)基础液制备：量取

20、蒸馏水600毫升。加入各无机盐成份、谷氨酸钠和丙三醇，100加热30 分钟，冷却。2)新鲜鸡卵液制备：洗净新鲜鸡卵表面，浸泡在70%乙醇或其它稀释消毒液中2030分钟。取出，擦干,开口，收集鸡卵液，搅匀。通过消毒的纱布过滤成鸡卵液。3)将600毫升基础液和1000毫升新鲜鸡卵液混匀。加2%孔雀绿水溶液20毫升，混匀，静置1小时后，分装6毫升至标准螺旋盖培养管或7毫升于中试管(1518180毫米)中。双层放置于搁架中，经培养基蒸汽凝固灭菌器，85灭菌50分钟。培养基斜面应占试管的2/3。灭菌后 ，37无菌试验24小时。制成的培养基斜面应颜色鲜艳，表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。无菌试验后，新

21、制备的培养基应4避光保存，一月内使用。2丙酮酸钠培养基：基础液 谷氨酸钠(纯度99%以上) 7.2克 磷酸二氢钾 2.4克硫酸镁(MgSO47H2O) 0.24克柠檬酸镁 0.6克丙酮酸钠 1.6克葡萄糖 4.0克蒸馏水 600毫升无机盐和有机物试剂均应采用化学纯(CP)试剂新鲜鸡卵液 1000毫升2%孔雀绿水溶液 20毫升制备方法：基础液制备：除冷却后加入葡萄糖外，丙酮酸钠培养基制备同上。 (三)前处理 视痰标本性状，加12倍体积4%氢氧化钠(NaOH)消化液于痰瓶中，涡旋振荡器振荡23分钟 ，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液后起，整个处理时间不得超过20分钟 。样本数较多时，

22、应分批处理。 (四)接种 吸取经前处理后的痰液01毫升，均匀接种在整个培养基斜面。每份标本接种两支酸性罗氏培养基，同时可补充接种一支丙酮酸钠培养基，以利于牛分支杆菌和一些耐药结核分支杆菌的生长。或同时接种酸性罗氏和丙酮酸钠培养基各1支。接种后，37平卧放置斜面24小时。然后，拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞，直立放置，37继续培养。含溴化十六烷基吡啶(CPB)防腐的痰标本，在接种前需用生理盐水或蒸馏水定溶至30毫升，3 000xg离心30分钟，再以生理盐水或蒸馏水洗涤沉渣2次。低温时，因溴化十六烷基吡啶(CPB)产生沉淀，需先将样本置37，使沉淀重新完全溶解后，再洗涤离心。同上，接种0.1ml 沉渣

23、。(五)结果与报告 1抗酸杆菌生长报告：接种后第3天、第7天各观察一次。3天发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长抗酸杆菌。以后，每周观察一次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告抗酸杆菌生长。培养阴性结果须在满8周时，即第9周开始时仍未见菌落者方可报告。观察时发现非抗酸杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应在25%范围内。污染率高，提示培养基灭菌不佳，标本处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。培养结果报告方式：抗酸杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长。抗酸杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的1/4。抗酸杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的1/2

24、。抗酸杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的3/4。抗酸杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满全斜面。 抗酸杆菌培养阴性应以(培养阴性)报告，不能以(-)表示。菌落生长不足以斜面面积1/4时，实报菌落数。 污染菌生长程度报告方式：C1+：污染菌占培养基斜面1/4以下者。C2+：污染菌占培养基斜面1/2以下者。C3+：污染菌占培养基斜面3/4以下者。 C4+：污染菌占培养基全斜面。LQ：培养基液化。若抗酸杆菌和污染同时存在于同一斜面上，应同时报告。2鉴别培养基：在分离培养基上缓慢生长的抗酸杆菌，需经PNB和TCH鉴别培养后，方可初鉴为结核分支杆菌、牛分支杆菌或非结核分支杆菌。制备：1)对硝基苯甲

25、酸(PNB)培养基：二甲基甲酰胺少量溶解PNB后，加入改良罗氏培养基的基础液中，使整个培养基终浓度为05毫克/毫升，培养基凝固灭菌同前。2)噻吩2羧酸肼(TCH)培养基：5毫克TCH溶于10毫升蒸馏水中，取1毫升加入100毫升罗氏培养基基础液中，使整个培养基终浓度为5微克/毫升，培养基凝固灭菌同前。接种：于玻璃研磨器中研磨临床分离培养物成10-2毫克/毫升均匀菌液，接种0.1毫升于上述两种鉴别培养基上和对照改良罗氏培养基上。37培养，每周观察一次，四周后报告生长结果。鉴定：在药物敏感性测验同时，进行PNB和TCH鉴别培养基测验，可提供临床分离株的初步种的鉴定结 果。需要时，可辅以硝酸还原试验、

26、烟酸试验和耐68热触酶试验。或提交省参比实验室鉴定。临床分离株种的初步鉴定 七、痰菌检验质量控制方案 (一)痰涂片检查质控 实验室痰检质量控制，包括室内质控和室间质控两种形式。1室内质控：室内质控范围包括痰标本收集、染色剂制备、涂片制备、染色、显微镜维护、显微镜镜检、标本、结果登记以及痰片的保存。室内质控内容：1)痰标本收集：痰盒 采用国家结核病参比实验室统一的螺旋盖痰瓶，或可密封有盖塑料盒、蜡纸盒收集痰标本。痰容器应标明病人姓名、送检日期及初诊病人门诊序号(或随访病人登记号)。痰标本性质 合格的痰标本应为深咳痰液。肉眼观察痰标本，按下列类别记录痰液 性状：脓样痰、干酪样痰、血性样痰、脓性粘液

27、痰和水样痰。2)萋-尼氏染色液的制备：检查配制记录和配方。染色液试剂瓶须标明染色液名称、浓度和制备时间。染色液须于棕色瓶内存放，避光保存。3)玻片：用于涂片的载玻片，应经95%乙醇脱脂后的清洁无划痕的新玻片。1张载玻片只能涂沫1份痰标本。载玻片只允许使用1次，不得清洗后重复使用。载玻片背面的左侧1/3处，标明病人姓名、实验序号。载玻片正面的右侧2/3中央处涂沫0.050.1毫升痰标本，面积为2.52.0厘米 ，厚度适当。4)染色：肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀淡蓝色，无红色斑块。 染色后的成片的痰膜脱落部分，应小于整个涂沫面积的10%。5)镜检：镜头清晰，无霉菌生长。油镜下视野背景清晰。镜下抗酸

28、杆菌应为红色，背景为淡蓝色。镜下可见炎性细胞，支气管粘膜细胞等痰细胞，平均每油镜视野细胞数不少于10个 。6)厚薄：肉眼观察痰膜应均匀，厚薄适当。镜检可见23水平层。合格片应90%。7)读片：抗酸杆菌阳性片符合率98%，阴性片符合率96%。不允许1+以上的阳性片出现假阴性。8)登记和痰片保存：登记 对所检查的每一份痰标本，应按结核病细菌学实验室登记本准确记录。 痰片保存 镜检后的痰片，必须用二甲苯充分去除表面的香柏油，不得用它物擦拭膜。待玻片干燥后，重新在每张玻片的左侧1/3处贴标签，注明序号、镜检结果与日期。存 放于玻片盒内。按阳性和阴性片分类保存近期3个月内的全部痰涂片，备上级实验室复验。质控方式：自查：查痰员当日抽片自查；互查：多名查痰员应由轮值人员抽查当日10%痰片。结果应有室内质控记录备查。2室间质控：质控模式：质控范围：1)督导内容：实验室布局实验室安全防护和污染物处理涂片、染色操作 显微镜维护状况抽取痰涂片复验实验室日常工作记录(包括室内和室间质控)2)督导方式：现场督导 上级实验室检验人员赴基层实验室现场指导，抽取痰片复验。非现场督导 基层实验室将保存近期3个月的全部痰片，及实验记录，送上级实验室 复验。国家参比实验室以非现场督导为主。省