人类全基因组SNP分型芯片检测先天性智力低下患者1例#精制材料

1、人类全基因组SNP分型芯片检测先天性智力低下患者1例曹烁 程寅龙 叶萃德染色体核型异常是儿童智力低下的最常见的病因，对智力低下的儿童进行核型分析，可以明确诊断患儿的染色体。传统的核型分析虽然是目前染色体异常检测的金标准，但亦有其局限性。随着人类基因组测序的完成以及分子遗传学研究方法的进步，对患者进行分子核型的检测已经成为临床遗传学的发展趋势，是对传统核型分析的有效补充，本研究拟采用核型分析以及人类全基因组SNP分型芯片检测1例先天性智力低下患儿。1.对象和方法1.1研究对象 患儿，女，1岁，生长发育迟缓，智力水平低下，眼距宽，鼻梁低平，眼裂小，眼外侧上斜，有内毗赘皮，外耳小，硬腭窄小，头围小于

2、正常，骨龄落后于年龄；头发细软而较少；四肢短，关节过度弯曲，手指粗短，小指向内弯曲。1.2 研究方法1.2.1 外周血染色体核型分析 (1)接种 取肝素抗凝的外周血0.5ml无菌接种于1640培养基中。 (2)培养 将接种后的标本置于37。C中培养72小时。 (3)收获 将培养物进行低渗、预固定、固定、过夜、滴片、烤片。 (4)对染色体进行G显带处理。 (5)显微镜下进行核型分析 计数30个分裂相，分析5个分裂相。 (6)染色体辅助分析系统进行资料储存，打印报告。1.2.2 人类全基因组SNP分型芯片检测 酚-氯仿的方法提取基因组DNA (1)取1ml左右外周血于EDTA抗凝管中

3、。 (2)加入20ul蛋白酶K，置于60水浴中2h。 (3)加入酚：氯仿：异戊醇(25:25:1) 300l:300l:12l，置于离心机中12000 r/min离心10min。 (4)将上清置于另一Eppendorf管中，然后加入2倍体积的无水乙醇，置于室温沉淀1min，12000r/min离心10min。 (5)弃上清，再加入1ml无水乙醇抽提一次，弃上清，控干Eppendorf管。 (6)加入100l的TE缓冲液或蒸馏水溶解。测定DNA模板的浓度(1)以移液枪吸取样品（12l）滴加到检测平台上。 (2)放下取样臂。(3)获可得样品参吸光度和浓度。 (4)用干净的吸水纸擦去上

4、下检测平台上的样品。 (5)A260/280在1.62.0之间，说明DNA纯度合格，同时经测定DNA浓度。 SNP微阵列检测 采用Illumina HumanCytoSNP-12芯片对提取的DNA进行检测，实验分3天进行，流程如图1(1)实验第1天：将标本置于96深孔板中，按照Illumina公司提供的infinium HD试剂扩增（扩增1000倍），处理实验标本，处理完毕后将96深孔板置于Illumina 杂交炉中，37保温扩增13h。（扩增区与扩增后区域应该严格分开，防止污染）。(2)实验第2天：DNA片段化、沉淀、重悬、杂交（杂交时间12小时左右，不应超过24小时）。(3)

5、实验第3天：芯片洗脱、真空干燥、上机扫描、分析结果。图1 Illumina HumanCytoSNP-12实验的流程图2. 结果2.1 外周血染色体核型分析 对患儿进行染色体核型分析，核型为46,XX,-10,+?10，患儿10号染色体多出一条带，经分析无法确认其来源。核型图见图2 图2 患儿核型46,XX,-10,+?102.2 SNP微阵列检测 对患儿进行人类全基因组SNP分型芯片检测，发现10号染色体多出的这条带的来源为10q21.3-q23.31，一个23.7Mbp的重复片段，从而明确其来源。分子核型见图3 图3 分子核型46,XX,dup(10)( q21.3-q23.31,23.7

6、Mbp),10号染色体异常部分3. 讨论染色体异常是患儿先天性智力低下的主要病因，对先天性智低患儿进行染色体检测可以明确诊断，为患儿的预后评估提供可靠的依据。染色体的检测方法中G-显带的染色体核型分析技术是细胞遗传学诊断的金标准，亦是目前普遍采用的方法，其能够同时检测出染色体数目的异常及大片段结构的异常。其基本原理为人体外周血淋巴细胞从细胞分裂间期进入分裂中期，经秋水仙素处理后，使细胞分裂停止在有丝分裂的中期，用显微镜可以观察到染色体的数目和结构。这种方法的优点在于能直观地观察到染色体的结构与数目，对于大片段（10Mbp）的缺失与重复提供可靠的依据。但此种方法也有不足之处，主要是操作繁琐，需要

7、手工操作，耗费大量的人力，而且培养周期长，染色体的观察需要由经验丰富的研究人员完成，对于某些不明来源的区带无法确诊。基于微阵列的基因组拷贝数量分析是目前最先进的临床遗传学检测方法，该方法又被称为CMA或分子核型，包含aCGH与SNP微阵列技术。与G-显带核型分析可以识别并检测染色体的重排，包括基因组的获得与丢失相比，CMA检测也具有相似的功能，同时对基因组的不平衡即染色体微缺失或微重复的检测具有较高的分辨率，该方法不需要培养，故已经成为分子遗传学检测最具发展潜力的方法。SNP检测方法的原理是：SNP是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化,而且任何一种等位基因在群

8、体中的频率不小于1%。以SNP用作遗传标记进行基于微阵列的基因组拷贝数量分析，可以检测染色体的微缺失、微重复等，可以得到患者的分子核型。本研究患儿经过外周血染色体核型分析，发现其10号染色体多一条带，但用传统的方法无法确认其来源，所以进而采用SNP微阵列技术检测其分子核型，发现这条带是10号染色体q21.3-q23.31区域的自身重复，此位置有与智力低下相关的基因存在，从而找出患儿智低的遗传学方面的原因，提示患儿预后不良，只能通过早期干预，开发患儿的智力水平。同时建议其父母进行染色体核型分析，以进一步研究患儿染色体异常的机制。参考文献1. 曹娟,范琦慧,陈志央,等. 227例染色体病胎儿病例的回顾分析.中国优生与遗传杂志,2015,1:34-36.2.范永红,王琳.589例产前筛查高风险孕妇的产前诊断.中国优生与遗传杂志,2015,2:63-64.3.Miller DT,Adam MP,Aradhya S,et al.Consensus statement: chromosomal micro- array is a first-tier clin