单个细胞分离技术PBMC

1、美丽的海医校园,临床免疫学实验指导海南医学院,实验六单个核细胞分离及细胞免疫功能检测,【实验目的】1.熟悉淋巴细胞分离方法2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义,T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的单个核细胞（L,M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.临床上反复感染者和肿瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫缺陷的检测，而这种检查的第一步就是单个核细胞的分离，计数。然后进行功能检查。,一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）（一）葡聚糖泛影葡胺法分离单个核细胞,密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自

2、然停转1.分离液：葡聚糖-泛影葡胺混合液（比重1.0751.092之间）将分离液，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层，单核细胞比重较小（1.0751.090），分布于血浆与分离液的交界处。界限清楚，层次分明。将该层细胞吸出，即为单个核细胞（主要为淋巴细胞）血浆和血小板位于最上层。血小板在血浆中下部2.Hanks缓冲液：（pH7.2-7.4,无Ca、Mg离子）3.0.4%台盼蓝染液,梯度离心法分离提取单个核细胞,稀释血浆内含血小板,分离液粒细胞红细胞,用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻

3、轻吸取单核细胞层于另一试管内加入PBS洗液3-4ml，离心洗涤2次，1500/r,10min.弃去上清，留约50l.加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml，混匀充池，镜下计数。,单个核细胞,2000rpm/20-30min,肝素抗凝血2ml+Hanks液2ml液稀释沿管壁缓慢加入到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中(不能破坏二者的液面）,2000r/min离心20min吸出淋巴细胞层加入另一试管中，加34mlHanks液，混匀离心洗涤，1500r/min离心10min弃去上清，再加3mlHanks液，混匀，1500r/min10min，重复洗涤2次重复1次末次离心后，弃去上清液。加含10%

4、灭活小牛血清/HanKs液加至1.0ml，混匀，灌入血细胞计数池，单个核细胞计数，于低倍镜下计数4个角大格内细胞总数。,方法,留取约50l,加缓冲液至1.0ml，稀释20倍,计数细胞方法,加样：将淋巴细胞悬液混匀，吸取10l加入到40l含10%灭活小牛血清的Hanks液中，混匀后再吸取10l充入计数板上。细胞悬液稀释5倍。此稀释也可省略，可根据细胞密度而定静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。具体计数方法如下：,血细胞计数池的构造,大方格9个中方格分2种WBC计数区分16个RBC计数区分25个3.小方格1种，是指RBC计数区的1个中方格又分16个小方格，即：计数池内有：1种大方格；2种中方格；1

5、种小方格池深0.1mm,血细胞计数池的构造参数4种方格的体积（容积）计数池区域边长（mm）面积（mm2）池深（mm）体积（mm3ul）一个计数全池390.100.90大方格110.100.10白细胞中方格0.250.06250.100.00625红细胞中方格0.200.04000.100.00400红细胞小方格0.050.00250.100.00025,细胞计数原则计左上，不计右下,血细胞计数板,血细胞计数板上四个角的四个大方格,1个大方格中16个中方格,计数血细胞计数板上四个角的四个大方格内单个核细胞总数。（只计算上边和左边的压线细胞，右边和下边压线细胞不计算）,单个核细胞总数计算：是指最终

6、制备的每ml细胞缓冲液内的单个核细胞的密度（数量）,单个核细胞总数/ml=,单个核细胞总数/ml=X/410(稀释倍数)103=X104,4,4个大方格内细胞总数,稀释倍数104,关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。此缓冲液中的单个核细胞密度。,细胞存活率检测,取10l淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10l，混匀。取10l加入血细胞计数板，静置片刻，置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式，报告活细胞存活率。【结果判定】活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入细胞内，故

7、死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测,在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数，计算其存活率：使用血细胞计数器：,细胞存活率=,活细胞数(N),活细胞数+死细胞数200,100%,例如：活细胞总数为120个，存活率为：60%；若活细胞计数为180个，存活率：90%,【临床意义】,分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一，是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作；是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要，不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，也用于进一步纯化淋巴细胞，进行淋巴细胞分类，分群，表面抗原，各种标志物以及其他淋巴细胞功能测定等。,实验报告：报告单个核细胞计数总数结果报告单个核细胞存活率3.简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理4.分离单个淋巴细胞的临床意义,T细胞总数测定：Et花环实验。学生课余自学内容。E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值：60%-80%由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。,T细胞总数测定Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）,人类T细胞的主要标志的CD