第三章-吸附层析...ppt

1、第三章 吸附层析,层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的。,层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法,吸附层析（absorption chromatography）又称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法。,吸附层析的概念,教学目的,掌握基本原理和操作方法 吸附柱层析 薄层层析 聚酰胺薄层层

2、析,层析方法的类型,第一节 吸附柱层析,吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相制备成色谱柱，以有机溶剂或缓冲液为流动相，用于分离纯化的一种层析方法 。,吸附柱层析的概念,吸附层析的 固定相,极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等,非极性：如活性碳等,流动相通常为有机溶剂或缓冲液,一、常 用 术 语,1固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用,2流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层析中又称为展

3、开剂,3层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换，最终使混合物得到分离的过程。,4操作容量 是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。,5床体积(Vt) 是指膨胀后的基质在层析柱中所占有 的体积(Vt)。它是基质的外水体积(Vo) 和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总 和，详见图3-1，即V=Vo+Vi+Vg,6洗脱体积(

4、Ve) 是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve 表示(见图3-7中OB),7外水体积(Vo) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和 8内水体积(Vi) 内水体积是指基质颗粒内部体积的总和 9基质体积(Vg) 基质体积是指基质自身所具有的体积。 Vo、Vi和Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的,10膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（用V表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大 11分配系数 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示 12.迁移率 指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动

5、相移动距离之比值。常用Rf表示,二、基本原理,利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间吸附能力的差异（或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大（或分配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸附能力小（或分配系数小）的组分很快被洗脱。 混合物在层析柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的过程,三、吸 附 剂,（一）吸附剂的选择,1.具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉等 2.选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。根据“相似相溶”原理，为了便于解吸附（洗脱），对于极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱的分离物则选择极性强的吸附剂。,（二）吸附剂的性质,20世纪50

6、年代初期，Tiselius等用制备的羟基磷灰石Ca5(P04)3OH2（HA）分离蛋白质。目前国内已有商品出售,1.羟基磷灰石,（1）性质,吸附容量高 稳定性好（T85，pH5.510.0均可使用） 使用广泛（可用于制备和纯化pro、酶、核酸等） 分离效果好 HA的Ca基团与生物分子表面的负电荷基团的作用，对分离起重要作用；而PO4基团与生物分子表面的正电荷的作用仅起次要作用,使用HA作为固定相基质时应注意,HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到23ml/g后，按16加入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒 HA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、玻棒等易破坏其晶体结构 忌用柠檬酸缓冲液和pH5.

7、5的缓冲液处理 色谱柱再生时，先用1 mol/L NaCl洗涤，然后用4倍床体积的平衡缓冲液冲洗即可 细颗粒HA的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用较大直径的柱子,2.硅胶,（1）性质,含水量：含水量高，则吸附性（活性）小，当其表面游离水含量17%时，其结合力很小；此时仅能作为分配层析的固定相 粒度：粒度小，则分离效果较好（如用200400目的硅胶能有效地分离多种主物的有效成分）,（2）活化：110烘烤0.51h。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中,四、洗脱剂,条件,纯度较高 稳定性好 能较完全地洗脱下被分离的成分 黏度小 易和所需的成分分开 选择洗脱剂的顺序应从极性小 大,一般，pro或

8、核酸被极性强的HA吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。,五、层析柱的制备和层析操作,（一）层析柱 层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱子的直径与长度之比一般为110-140；吸附剂颗粒极细时，宜选用大比例（粗）的层析柱，反之用细层析柱，这样可节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积由吸附剂的量和膨胀度决定,吸附剂的用量主要由吸附剂自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定（一般为被分离样品的30-50倍）。 当操作容量小时，则吸附剂用量要大；另外，当样品中各组分的性质相似，难以分开时，应加大吸附剂的用量，有时甚至超过100倍。,（二）

9、吸附剂的用量,（三）装柱,1.干法装柱,直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂，此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀,2.湿法装柱,先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图3-5）；待其自然沉淀至柱高的1/4 - 1/3 时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用2-3倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡,注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡,（四）上样和洗脱,经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品

10、液体积应小于床体积的1/2）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通，分级收集。,将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成分能完全分离（图3-7） 为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度下降） 分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存,加 样 操 作 示 意 图,（五）柱子再生,各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异,(1)纯化生命物质72：,天然的双链(ds)和热变性单链(ss)

11、小牛胸腺DNA在HA层析柱的分离图谱,六、实例应用,(2)分离蛋白质的亚基114,14C-组氨酸标记的兔球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱,第二节 薄 层 层 析,薄层层析(thin layer chromatography，TLC)是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法,薄层层析的概念,1展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需15-60min 2设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备 3温度变化和溶剂饱和程度对Rf值影响较小 4可使用腐蚀性显色剂(用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固定相的薄板除外) 5灵敏度高,薄层层析有以下优点,第三节 聚酰胺薄膜层析,聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方法。特别应指出的是，