细菌鉴定中常用的理化生化反应

1、实验日期：2017年11月1日实验班：生物技术讲师：张健利姓名：高希雪诺。1120152430细菌鉴定中常用的理化和生化反应一、实验目的1)了解细菌的生理生化反应原理2)通过细菌对不同碳氮化合物的分解和利用，了解细菌碳氮代谢类型的多样性。3)了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴定细菌中的意义。二、实验原理1)糖(酒精)发酵实验由于细菌中含有不同的酶，它们在糖(酒精)发酵后的代谢产物也不同，即它们能产生酸和气体，或者它们能产生没有气体的酸。产酸可通过培养基中溴甲酚紫(pH5.2黄-6.8紫)的颜色变化来判断，即发酵产酸时，培养基可由紫色变为黄色。可以通过发酵管中倒置的杜氏细管中是否存在气

2、泡来判断气体的产生。2)甲基红实验(磁共振实验)许多细菌，如大肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解成甲酸(或乙酸乳酸)，因此培养基的酸碱度降低到4.2以下。此时，加入甲基红指示剂以显示红色。产气细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养基的酸碱度在6.2以上，此时加入甲基红指示剂，呈黄色。3)伏日-普罗斯考尔实验4)靛蓝基质(吲哚)实验大肠杆菌可以分解蛋白质中的色氨酸，产生靛蓝基质(吲哚)，靛蓝基质与对二甲氨基苯甲醛结合，形成玫瑰靛蓝基质(红色化合物)。5)硫化氢实验一些细菌能分解含硫氨基酸(胱氨酸半胱氨酸等。)在培养基中产生硫化氢和铅盐或铁盐，形成黑色沉淀的硫化铅或硫化铁。这是一个硫化氢实验

3、。6)明胶液化实验有些细菌含有胶原酶，使明胶分解，失去凝结能力，呈液态，这对于明胶实验是有积极意义的。7)淀粉水解实验细菌不能直接利用淀粉，但淀粉必须被淀粉酶水解成小分子糊精或进一步水解成葡萄糖(或麦芽糖)，然后被细菌吸收利用。细菌水解淀粉的过程可以通过改变底物来证明，即当加入碘溶液时，不再产生蓝色。8)柠檬酸利用实验产气细菌可以以柠檬酸钠为碳源生长。它分解柠檬酸生成碳酸盐，培养基呈碱性，使培养基中溴百里酚蓝指示剂由绿色变为蓝色。不能使用柠檬酸盐作为碳源的细菌不会在培养基上生长，培养基也不会变色。三、实验试剂和设备实验仪器和用具：恒温培养箱、试管、无菌盘、杜氏细管、接种环、酒精灯；微生物材料：

4、大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌斜面；试剂：甲基红试剂、钒磷试剂、吲哚试剂(甲、乙)、卢戈氏碘溶液；中等：葡萄糖和乳糖发酵培养基(糖发酵实验)葡萄糖蛋白胨水培养基(甲基红和v.p .实验)胰腺蛋白水介质(吲哚实验)柠檬酸铁铵或醋酸铅半固体介质(硫化氢实验)明胶培养基(明胶液化实验)淀粉培养基(淀粉水解实验)柠檬酸钠斜面培养基(柠檬酸盐利用实验)硝酸盐培养基(硝酸盐利用实验)。四.实验步骤1)糖(酒精)发酵实验1.序列号：在试管上注明培养基名称、接种细菌名称和组号。2.接种：取三种葡萄糖发酵培养基，一种接种大肠杆菌，一种接种变形杆菌。留下一个作为对照。3.乳糖发酵试验的接种方法与葡萄糖

5、发酵试验相同。将接种后的培养基置于37在培养箱中培养24h。4.结果：细菌能发酵培养基中的糖，可降低培养基的酸碱度，培养基中的指示剂呈酸性反应(黄色)。如果糖产生酸和气体，不仅培养基是黄色的，而且倒置的培养基中也有气体2.一个接种大肠杆菌，一个接种产气杆菌，一个不接种作为对照。37培养孵育48小时后，加入几滴甲基红指示剂并观察结果。3.结果：红色表示阳性，黄色表示阴性。3)视听实验(视听实验)取3个葡萄糖蛋白胨水培养基，1个接种大肠杆菌，1个接种产气杆菌，1树枝作为对照。在37培养48小时后，取出，加入5-10滴40%氢氧化钾5-10，然后加入等量的5%-萘酚溶液，剧烈摇动，然后放入37的培养

6、箱中15-30分钟以加速反应。如果培养物是红色的，它对伏安反应是阳性的。4)靛蓝基质(吲哚)实验取三种胰蛋白胨水介质，一种接种大肠杆菌，一种接种产气杆菌，另一种作为对照。在37培养24-48h后，沿试管壁向培养物表面滴加几滴吲哚试剂，观察结果显示玫瑰红为阳性，不变颜色为阴性。5)硫化氢实验穿刺接种三种乙酸铁或柠檬酸铁半固体培养基，一种接种大肠杆菌，一种接种变形棒，一种作为对照。如果有黑色的降水线，它将是正的。6)明胶液化实验穿刺接种三种营养明胶培养基，一种接种大肠杆菌，一种接种枯草芽孢杆菌，一种作为对照。在37培养48小时后，将明胶培养基轻轻放入4的冰箱中30分钟，观察明胶的液化。如果明胶不凝

7、结，表明它已经被细菌液化，这是一个积极的结果。7)淀粉水解实验1.冷却到50的淀粉介质通过无菌操作制成平板。2.用接种环取少量枯草芽孢杆菌接种于平板的一侧，然后取少量大肠杆菌接种于平板的另一侧。3.在37培养箱中培养24小时。4.打开培养皿，将少量卢戈氏碘溶液滴在平板上，轻轻摇动，使碘溶液均匀分布在整个平板上。如果真菌苔藓中有一个透明的圆圈，说明淀粉已经水解。透明圆圈的大小表明了真菌水解淀粉的能力。8)柠檬酸利用实验取三种柠檬酸盐斜面培养基，一种接种大肠杆菌，一种接种产气杆菌，一种作为对照。3724h培养结果表明，培养基呈深蓝色为阳性。如果培养基没有改变颜色，它继续培养5-7天，但是培养基仍然

8、没有改变颜色是阴性的。9)硝酸盐还原实验取三种硝酸盐培养基，一种接种大肠杆菌，一种接种枯草芽孢杆菌，一种作为对照。在37培养18-96小时，每天吸取2ml培养液，加入1滴格氏试剂A和B，呈粉红色、玫瑰色、橙色或棕色。如果没有阳性反应，可以加入1-2滴二苯胺试剂。如果培养液是蓝色的，则意味着硝酸盐仍存在于培养液中，但不存在亚硝酸盐，否则意味着硝酸盐和新形成的亚硝酸盐存在，但不存在亚硝酸盐。V.实验结果和分析(1)糖(醇)发酵实验：37培养24h，葡萄糖(图1):大肠杆菌：产酸产气；普罗透斯：酸和气体生产。乳糖(图2):大肠杆菌：产生酸和气体；普罗透斯：没有明显的变化图1、图2、图3和图4(2)甲

9、基红试验(图3):37培养48小时后，加入几滴甲基红指示剂，大肠杆菌：红色(阳性)；产气杆菌：黄色(阴性)(3)静脉注射实验(图4):在37培养48 h，取出，加入5-10滴40% KOH 5-10，然后加入等量的5%-萘酚溶液，剧烈摇动，然后放入37培养箱中15-30分钟。需氧细菌：培养物为红色(阳性)；大肠杆菌：无明显变化(阴性)(4)吲哚实验(图5):在37培养24-48小时后，沿试管壁在培养液表面滴几滴吲哚试剂。大肠杆菌：淡红色；产气细菌：浅红色。图5、图6和图7(5)硫化氢实验(图6):37培养24小时后，出现变形杆菌黑色沉淀(6)明胶液化实验(图7):在37培养48小时后，将明胶培

10、养基轻轻放入4的冰箱中30分钟，观察明胶的液化。枯草芽孢杆菌：明胶液化(阳性)；大肠杆菌：明胶不液化(阴性)(7)淀粉水解实验(图8):在37的培养箱中培养24小时，打开平板，将少量卢戈氏碘溶液滴在平板上，轻轻摇动，使碘溶液均匀分布在整个平板上。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌周围有透明圈，且枯草芽孢杆菌周围的透明圈大于大肠杆菌周围的透明圈，证明枯草芽孢杆菌对淀粉的水解能力较强。(8)柠檬酸盐利用实验(图9):当在37培养24小时时，好氧生物：培养基变成深蓝色(阳性)；大肠杆菌：培养基不变色(阴性)图8图9图10图11(9)硝酸盐还原实验：在37培养18-96h，每天吸取2ml培养液，加入1滴格氏试剂A

11、和B。24小时后(图10):加入试剂后大肠杆菌和枯草芽孢杆菌呈橙色(阳性)；48小时后(图11):加入试剂后，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌呈橙色(阳性)有关注意事项1.在实验中，使用没有接种细菌的培养基作为对照。由于亚硝酸盐在自然界中分布广泛，很容易污染试剂。此外，如果硝酸盐不纯或保存不当，可能含有亚硝酸盐。2.如果培养时间过长，繁殖速度快、还原硝酸盐能力强的细菌会将亚硝酸盐分解为氨和氮，从而可能发生假阳性反应，因此有必要每天进行实验。七、思考问题1.在吲哚实验和硫化氢实验中，细菌分解了哪些氨基酸？吲哚实验：细菌分解色氨酸。因为有些细菌含有色氨酸分解酶，可以将色氨酸分解为吲哚，所以加入吲哚试剂后会发生