制备型高效液相

1、制备型高效液相,制备型高效液相色谱是一种快速, 有效的分析分离工具。本文介绍了制备型高效液相色谱基础理论及基本装置, 介绍了样品的预处理和应用实例, 分析了目前制备型高效液相色谱技术存在的问题并对该技 术未来的发展进行了展望。,高效液相色谱分析法,High performance liquid chromatography,一、液相色谱仪器,流程图,近年来, 从自然资源中寻找具有生物活性化合物的探索 工作日益受到人们的关注。人们在运用高效的筛选方法, 从 植物、海洋生物及微生物中发现新的先导化合物的同时需要 一个快速、有效的分离方法以分离目标化合物, 而色谱技术 是迄今人类掌握的对复杂混合物分

2、离效率最高的一种方法, 能够分离物化性能差别很小的化合物1 。分析型H PLC 技 术一经出现就引起广大研究者, 特别是分析化学工作者的高 度重视, 使这项技术在分析应用方面取得了巨大成功。现在 随着人们大规模分离的需要, 制备型高效液相色谱技术也相 应产生了, 并受到了人们越来越广泛的重视。在我国, 该技 术已被列入 863 工程生物技术领域的攻关项目中 2。由于 技术上的原因, 长期以来制备型液相色谱技术发展缓慢, 但 是随着理论研究的深入, 新颖的填料、新的填充方法以及在 仪器和流程上的进展, 近年来该技术获得了很大的发展。,1基础理论 人们对色谱基础理论进行不懈的研究, 提出了众多的理

3、 论。其中比较著名的有: 1. 平衡色谱理论。在1940 年由 W ilson 3 提出, 该理论认为在整个色谱过程中, 组分在流动 相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成; 2. 塔板理论。在 1941年由M a rtin和Syng e 4提出, 该理论将色谱过程比拟为 蒸馏过程, 把色谱柱看成是由一系列平衡单元! 理论塔板所 组成。在每一个塔板高度内, 组分在流动相和固定相之间的 分配平衡能瞬间达成; 3. 纵向扩散理论。由Am undson 5 等人通过大量实验提出, 该理论认为在色谱过程中, 组分在流动 相的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张的主要因素, 而有限 的传质速率对区域谱带扩张没有影

4、响; 4. 速率理论。该理论 认为组分在流动相和固定相之间有限的传质速率是影响色谱 区域谱带扩张的主要因素, 而轴向扩散的影响可以忽略; 5. 双 膜理论。Funk等人把流动相和固定相看成是两块相互紧密接 触的平面薄膜, 整个传质阻力为流动相膜的传质阻力和固定 相膜的传质阻力所构成, 组分在界面接触处达到分配平衡。,简单大男,制备分离的色谱模型和分析分离的模型相似, 但在具体 操作中两者的指导思想却有着本质的不同。在制备分离中, 人们总是希望在尽可能短的时间里得到尽可能多的纯组分。 欲得到负载必须以分离效果为代价, 即在保持最低分辨率的 前提下, 使柱子超载以得到最大的物料通过量。而分析分离

5、中在最短时间里得到最大的分离效率则是人们希望得到 的 6 。制备分离选择的是高柱效、高柱容量的色谱柱, 而且 使色谱柱在超载状态下工作。所谓超载, 通常将理论塔板数 下降10%时柱容量 7。较为理想的制备条件的选择包括上 柱量, 容量因子, 选择性以及柱效 8。,2 基本装置 制备型H PLC是一种基于组分在固定相( 柱填料) 和流 动相(淋洗液)中分配系数的微小差异, 当二相作相对运动 时, 样品中的各组分将形成不同的迁移速度的谱带而实现分 离的新型高效分离技术。对于制备型HPLC而言, 装置不像对分析型HPLC那样关键, 使用不很高级, 价格较低的装置 往往可以获得令人满意的分离效果。 制

6、备型HPLC装置主要由输液泵、进样系统、色谱柱、检 测器、馏分收集器、数据采集与处理系统等部分组成。,2. 1输液泵 在制备型HPLC 不需要具有很高的输送压力, 一般为 19. 6MPa。输液泵采用的是恒流的机械往复泵或恒压的气动 放大泵较理想, 因为它们具有较高的输送速率和连续输出溶 剂的能力。然而当采用装入小颗粒固定相的粗柱进行制备 型HPLC时, 例外地需用能提供较大压力的泵。在某些场 合, 所需压力高达150bar, 此时采用薄膜泵较合适。对于内 径较小的制备柱可使用分析型的输液泵, 内径较大的制备 柱, 输液泵所需的输送能力可从分析型柱子所做的实验条件 参数计算出来。,2. 2进样

7、系统 在制备型H PLC分离中, 可以采用一个进样阀(如六通 进样阀) 将较大量的样品方便的注入柱子而不影响流动相流 动。通过更换样品环可以方便的改变进样量, 最大可达 10mL。如果使用注射器, 一般采用停留进样技术, 即样品在 常压下注入, 然后再从新起动泵。若样品量非常大, 可以采 用停留技术, 借助于一台小体积泵将样品定量地注入柱中。 也可采用隔膜进样法, 用注射器将样品定量地注入柱中。,2. 3色谱柱 相对于分析型色谱, 制备色谱的核心就是色谱柱。为提 供既稳定又高效的色谱柱, 并用小尺寸颗粒进行填充, 最常 用也是最易实现的效果较为理想的是动态轴向压缩柱 ( DACTM )技术 9

8、 。DAC技术为使用者提供了用任一种填料 自己装填色谱柱、方便快速地调整柱长度的可能性。在制备 型HPLC中, 色谱柱的内径可在100 500mm 之间。一般增 大色谱柱的直径意味着可以承载更多的样品, 从而增加产 量。增加色谱柱的长度则意味着可加入的样品量和分辨率 的增大, 但同时也增加了柱压。研究表明对于难分离物系, 可以采用直径较小的色谱填料, 以提高分离效率, 但在分离 度可以满足分离要求的前提下, 使用较大直径的色谱填料将 更为有利 10 。,2. 4检测器 在现有的检测器中, 示差折光检测器通常适用于制备分 离, 不过在某些系统中为了准确地检测样品中所有峰, 往往 需要将示差与紫外

9、分光光度检测器配合使用。也可用薄层 色谱对高浓度的流出液各流分进行检测, 所以当其他检测方 法不适用时, 可求助于薄层色谱检测,2. 5馏分收集器,在制备型分离工作中, 需使用大量的洗脱溶剂, 因此要 采用适当的收集器。若收集一个或几个已分离的组分, 用手 动馏分收集器即可。然而当大量样品组分必须一次分离或 为了提高一个或多个组分的收集量而要进行多次重复性分 离, 使用自动馏分收集器更为方便。 如有可能, 应对溶剂回收再用, 因而也应尽量不使用混 合溶剂 11 。在使用反相或聚合物吸附进行分离时, 有时从 水液中回收样品较困难。一种解决办法是蒸除其中的有机 溶剂, 然后用甲苯或氯仿提取残留水液

10、,2. 6数据采集与处理系统,国外的一些公司已经相继开发出商业化的具有某些人工智能特点的制备型HPLC 整套设备。这些整套设备均是 采用一台计算机控制整个仪器的运转, 并进行数据的收集、 贮存和处理等工作, 从而使制备型H PLC 的分离速度以及自 动化程度等大为提高。,3 应用 3. 1制备型HPLC的样品预处理,在高压液相色谱进样之前, 需对样品进行过滤。使用能 套在注射器上的滤片可以除去样品中混有的颗粒状杂质, 既 方便又廉价。颗粒状杂质可能损坏高压液相色谱仪的阀门, 阻塞管道或柱子入口端的滤板。滤片可以是不锈钢或塑料 套的, 但通常用一次性的聚丙烯外壳的滤片。这种滤片一般 有凹陷的入口

11、及一细凹的出口, 可与注射器相连。过滤膜的 材料可以是聚四氟乙烯、乙酸纤维、尼龙、纸或无机膜。在选 用过滤膜时应注意使其适合于所用的溶剂, 这一点在使用含 四氢呋喃的溶剂时尤其重要 12 。 在色谱柱与进样器之间安装前置柱可除去颗粒状杂质 和吸附性强的样品组分。前置柱通常装有少量与色谱柱相 同的填料, 如填充得当, 对系统分离效果不会造成很大影响。 硅胶预处理柱可防止含有缓冲盐或碱的流动相所引起 的麻烦, 上诉物质可破坏键合相填充料的硅胶骨架, 常会在 柱的上部形成空隙。预处理柱安装在泵与进样器之间, 这样 尽管流动相被硅胶所饱和, 但在进样途中不会有空隙或气泡,3. 2制备规模,按照分离一次

12、进样量的多少, 制备型HPLC 有3 种规 模, 即半制备级H PLC、克级H PLC 和工业级HPLC,如下表1所示。,制备型H PLC以生产纯物质为目的, 在经济合理的前提下, 规模越大越好,医学压力,演示文稿,3. 3柱超载方式 分析型HPLC与制备型HPLC的根本区别在于分离目的 不同 13 。在分析型中, 需要的是反映样品组成的信息, 不需 要收集达到特定纯度的馏分, 洗提液通常是作为废液来考虑 的。但在制备型HPLC 中, 为了节省投资和操作费用, 必须 以最少的时间生产最大量的产品。由于目的不同, 制备型 HPLC与分析型HPLC所选用的操作方式有显著不同。前者 要求进样量越小越

13、好, 而后者为了提高制备量, 柱必须超载。 柱的超载方式有两种, 一种是所谓的 质量超载 , 即维持较 小的进样体积, 但提高进样浓度; 另一种是所谓的体积超 载 , 即保持较小的进样浓度, 但增加进样体积。在制备型 HPLC中, 一般认为采用质量超载的方式较好。王志祥 14 等 人建立的混合池模型可以较好的描述制备型H PLC 分离过 程, 发现在制备型H PLC 分离过程中, 分离度和柱效均随质 量超载程度的增加而下降。但是, 在分离度可以满足分离要 求的前提下, 采用质量超载的方式操作, 可以提高制备量。,3. 4流动相 进行制备型液相色谱分离时, 所用溶剂的纯度很重要。 即使含纯化合物

14、的流动相溶剂中含有微量的不挥发性杂质,当大量溶剂经蒸发后, 其杂质浓度就会增高。制备型液相色 谱往往需消耗大量溶剂, 因此应在溶剂纯度与所用数量之间 进行权衡。流动相中的非挥发性添加剂会在产物回收时引 起麻烦, 这是可采用挥发性缓冲物来改进分离效果, 又易于 将其除去。,3. 5洗脱 制备型H PLC 所采用的洗脱方式主要有两种。一种是 维持流动相的热力学参数不变的等度洗脱法; 一种是改变流 动相的一种或几种热力学参数的梯度洗脱法,3. 6被分离物质的收集 在制备型分离工作中, 需使用大量的洗脱溶剂, 因此要 采用适当的收集器。如有可能, 应对溶剂回收再用, 因而也 应尽量不使用混合溶剂。在使

15、用反相或聚合物吸附剂进行 分离时, 有时从水液中回收样品较困难。一种解决办法是蒸 除其中的有机溶剂, 然后用甲苯或氯仿提取残留水液。 如以甲醇- 水为洗脱液, 可将收集的流分用水稀释5 倍, 用泵加回到色谱柱上, 然后用甲醇将化合物洗脱下来。 如从环肽中脱盐时, 先用水洗脱重新加到柱上的流分, 然后 用纯甲醇洗脱所需成分另一种方法是将收集的样品加到 Sephadex LH - 20柱上, 如Seto 等 15 在从植物蔷薇中分离黄 酮苷时, 采用此法以水洗除H PLC 洗脱液中含有的磷酸, 而 后用甲醇将纯化合物洗下。 目前的发展趋势是实现进样与流分收集的自动化, 这样 可进行连续的操作及反复

16、的分离 16 。,4在天然产物研究中的应用实例,肖伟涛, 朱小兰等人用制备高效液相色谱技术对25%茶叶提取物中茶氨酸进行制备、分离纯化。所得产品用外标法定量分析, 纯度大于98%, 制备收率大于60% 17 。彭密军,周春山等人采用制备型H PLC 分离纯化, 制备回收率为83.3%, 相对标准偏差为3. 1%, 绿原酸的纯度达98. 61%, 同时可得到杜仲叶黄酮、桃叶珊瑚甙等副产品18 。徐光国 19 运用国产YZS- 3型制备液相色谱仪分离制备了抗癌药葫芦素B标准品, 茯苓三萜酸成分和金银花中的主要成分绿原酸;陈若芸 20 等用制备液相色谱技术制备了灵芝中的三萜类化合物; 张仁斌 21

17、等用该技术对青蒿素异构体进行了分离制备。李军等用制备型H PLC 对曲克芦丁原料进行分离纯化制得曲克芦丁对照品, 纯度可达99%以上 22 。仲英等利用高效液相色谱Deltaprep 3000制备系统纯化药典用葛根素对照品 23 。陈晓辉等利用制备型HPLC对野菊花的黄酮类化学成分进行分离研究, 分离纯化了6个化学品, 纯度均为99%以上24。尚庆坤等使用制备型H PLC 法分离虻虫中的多肽样品, 制备收集了4 种主要组分, 经检测各组分达到很高纯度 25 。彭密军等使用制备HPLC从杜仲样品中同时制备了AU、GPA、GP3种单体 26 。,5结语,与其他制备方法相比, 液相色谱是目前技术手段最成 熟、应用最为广泛的一种。但是它的缺点也很明显 27 , 如需 消耗大量溶剂、产品过于稀释以及往往无法避免有毒溶剂的 使用。另外色谱技术的最大弱点是定性能力差。因此将分 离手段和分析手段联合成为一个整体, 再配上专用的计算 机, 已成为近代分析仪器发展的又一个重要方向。当前对各 种检测手段及联机的接口, 都还趋于摸索阶段或者只适用于某些领域, 例如H PLC - AAS ( 原子吸收)、HPLC - LC ( 质 谱)、HPLC- 化学发光法、HPLC - 化学发光法、HPLC - 电