产酶微生物的分离与筛选课件

1、产酶微生物的分离与筛选,Chapter 2 Isolation and Purification of Microorganisms Producing Enzyme,产酶微生物的分离与纯化,产酶微生物的分离与筛选,酶的生产方法,提取分离法 (Extraction),生物合成 (Biosynthesis),化学合成 (Chemicalsynthesis),SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase

2、 from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus Plant cell culture Animal cell culture,Few example,产酶微生物的分离与筛选,Contents of chapter 2,2.1 产酶微生物 2.2 产酶微生物的分离和筛选 2.3 产酶微生物优良菌种的选育 2.4 产酶微生物原生质体融合育种 2.5 基因工程育种,产酶微生物的分离与筛选,2.1 常见产酶微生物,基本要求： 不是致病菌 发酵周期短,产酶量高 不易变异退化 最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。 对医药和食品用酶,还应考虑安全性： 凡从可食部分或食

3、品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全! 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。,产酶微生物的分离与筛选,(1) 大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。,形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。 Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。 应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖

4、大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等,产酶微生物的分离与筛选,(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）,菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维C中间体）,产酶微生物的分离与筛选,(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。 枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉

5、酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。,产酶微生物的分离与筛选,(4) 根霉(Rhizopus),分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。 根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。 分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。 代表种：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。 应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。,产酶微生物的分离与筛选,(6)曲霉(Aspergillus),分类：多数属于子囊菌亚门

6、，少数属于半知菌亚门。 分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。 代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲霉Asp.flavus 应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。,回本节,产酶微生物的分离与筛选,菌种选育,野生菌,自发突变,杂交育种,原生质体融合,基因工程,诱变育种,2.2 产酶微生物的分离与筛选,产酶微生物的分离与筛选,2.2.1 样品的采集,根据所要分离的微生物的特点：,纤维素酶：堆积和腐烂纤维素的地方褐腐态树木上

7、果胶酶：霉烂的果蔬上 淀粉酶：酿酒厂、淀粉厂周围的土壤 蛋白酶：肉质、豆制品常厂的周围,不了解产酶微生物的具体来源土壤,产酶微生物的分离与筛选,2.2.2 富集培养,添加特殊的营养物质 调整培养基的酸碱度 控制培养温度和热处理 添加抑制剂,产酶微生物的分离与筛选,2.2.3 分离,通常采用平板分离法。将含菌样品用无菌水或生理盐水稀释到适当的浓度，然后涂布在适当的平板上，根据微生物的种类选择培养条件。根据不同的微生物种类采用不同的培养基、抑制剂。,产酶微生物的分离与筛选,1. 胞外酶的产酶菌株的筛选方法 2. 胞内酶的产酶菌株的筛选方法 如果是胞内酶，则可采用以下两种方法来确定： (1) 固体培

8、养法 把菌种接入固体培养基中，保温数天，用水或缓冲液浸泡培养基，将酶抽提，测定酶活力，这种方法主要适用于霉菌； (2) 液体培养法 将菌种接入液体培养基后，静置或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异)，再测定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种供复筛使用。,2.2.4 初筛,产酶微生物的分离与筛选,2.2.4 初筛,通过平板分离的初筛法得到的产酶军注重，需要进一步复筛。复筛时可以采用几种代表性的培养基，在预定的几种培养条件下，对每一个菌株进行培养，并测定其产酶能力。 由于同一种菌株可因培养方式的不同表现出不同的产酶能力，因此，最好将摇瓶实验和小发酵罐实验相结合判断菌株的优良性。

9、,产酶微生物的分离与筛选,2.3 产酶微生物优良菌种的选育,2.3.1 优良菌种的诱变育种,诱变育种：是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。,1. 诱变育种,产酶微生物的分离与筛选,2 诱变育种方法,诱变育种的基本过程如下： 选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,（1）出发菌株的选择,a. 自然界直接分离到的野生型菌株 b. 经历过生产条件考验的菌株 c. 已经历多次育种处理的菌株,产酶微生物的分离与筛选,(2) 制备菌悬液,a. 待处理

10、的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。 b. 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水(0.85%NaCl)稀释。,表型延迟 Phenotypic lag ：所谓的表型延迟就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。,生理性延迟现象：生理性延迟现象，就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状。,产酶微生物的分离与筛选,(3) 诱变处理,通常是根据经验选择恰当的诱

11、变剂,对于已有诱变处理背景的菌株，变换使用其它诱变剂也许会得到较好的效果。,要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同的看法。有人认为应采用高剂量，就是造成菌体致死率在90%99.9%时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量(致死率在70%80%),甚至更低剂量(致死率在30%70%)，他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。,产酶微生物的分离与筛选,诱变剂及其诱发机理,1. 物

12、理诱变剂,物理诱变主要是采用辐射。如紫外线、X射线、射线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。,生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处，该波长也是微生物的最敏感点。紫外线诱变机理是它会造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应。,产酶微生物的分离与筛选,a. 交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。它会引起DNA复制错误，正常的碱基无法配对，造成错义或缺失。嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。,产酶微生物的分离与筛选,b. 过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA，或使交联的DNA无法打开，不能进行复制和转录，从而引

13、起菌体死亡。,c. 在正常的微生物细胞中，紫外线造成的DNA损伤是可以得到及时修复的。,光复活作用(photoreactivation)：若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降。光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶(photoreactivating enzyme)。光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。可见光光能(300-500nm)可以激活光复活酶，使之打开二聚体，将DNA复原。与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能.,产酶微生物的分离与筛选,暗修复(dark repair) 作用：

14、可修复由紫外线、射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。野生型大肠杆菌细胞的切除修复系统非但可以修复自身的DNA紫外线损伤，还能修复外来的噬菌体T1及T3等的DNA所受到的紫外线损伤。,产酶微生物的分离与筛选,重组修复(recombination repair)：重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复。,在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，可是在每个二聚体附近留一空隙。对于重组修复的机制并不象切除修复了解得那样具体，一般认为通过染色体交换，空隙部位就不再面对着胸腺嘧啶二聚体而是面对着正常的单链，在这种条件下DNA聚合酶和连接酶便起作用把空隙

15、部位进行修复。,产酶微生物的分离与筛选,2. 化学诱变剂,(1) 与碱基化学反应的诱变剂:烷化剂、亚硝酸和羟胺,烷化剂(alkylating agent)： 带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。,常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。,碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成6-烷基鸟嘌呤，并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。胸腺

16、嘧啶被烷基化后，可与鸟嘌呤错误配对。,产酶微生物的分离与筛选,碱基类似物:有5-溴尿嘧啶(5-BU)，5-氟尿嘧啶(5- FU)、8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP),它们与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。,产酶微生物的分离与筛选,移码突变的诱变剂:吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、 吖啶橙及 -氨基吖啶等)和称为ICR类的化合物,移码突变:是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变产生的突变体称为移码突变体。,作

17、用机制：它们是一种平面型的三环分子，与嘌呤-嘧啶碱基对的结构十分相似，故能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开(两个碱基对原来相距0.34纳米，当嵌入一个吖啶类分子时，就变成0.68纳米)，从而在DNA复制过程中，会使链中增添或缺失一个碱基，结果引起移码突变。,产酶微生物的分离与筛选,突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株，其他原养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。 为了有效地筛选突变株，必须采用使

18、新个体表型得以充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。,2.3.2 突变株的分离与筛选,产酶微生物的分离与筛选,常规的筛选程序,这是传统选育中常用的方法，挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定。,第三代、第四代直到选育到符合要求的优良菌株,产酶微生物的分离与筛选,2. 简便筛选程序,在常规筛选法基础上进一步改进：一方面分离在平皿上的菌落采用琼脂块法，每代诱变处理后打10003000块琼脂菌落，甚至更多。

19、另一方面，初筛摇瓶发酵液中产物分析，采用简便、快速的琼脂平板测定法或其他简便方法。,产酶微生物的分离与筛选,产酶微生物的分离与筛选,2 菌种筛选的手段,有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。,野生型,变异菌株,经13代诱变后，所获得的高产变株形态特征较原始的孢子颜色有灰绿变白色，菌落表面由松散变紧密，孢子量由多变少。,从菌体形态变异分析,产酶微生物的分离与筛选,碱性脂肪酶变株FS-1884变异前后的菌落形态,野生型,变异菌株,与野生菌相比，生长

20、慢，分枝少。孢子多颜色深绿，菌落背面有一个约为菌落面积2/3大的象牙黄核区，该区随着酶活性的提高逐渐变大。,一个菌株的高产性能是经过多代微小突变积累的，一代诱变后的菌落形态与直接亲本之间形态变化一般不明显。但是长期多代诱变后，高产菌株与其原始的亲代在形态特征上还是有显著差异的。 根据形态挑选菌落，仍然具有随机性，但是在淘汰大量的低产菌株的基础上挑取约200个菌落，进行摇瓶复证，这样比直接摇瓶筛选法获得高产菌株的概率要大。,产酶微生物的分离与筛选,平皿快速检测法,平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。具体的有纸片培养显色法

21、、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。,（1） 纸片培养显色,将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。,产酶微生物的分离与筛选,（2） 变色圈法,将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固

22、体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。 在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 筛选果胶酶产生菌时，用含.2果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2刚果红溶液染色h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。 分离内肽酶产生菌时，除了用酪蛋白外，还可以用吲羟乙酸脂为底物加到分离培养基内，产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸脂为3-吲羟吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根据呈色圈便可选出平板上产蛋白酶的菌落。,产酶微生物的分离与

23、筛选,（3） 透明圈法,在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源。要分离核算水解酶产生菌，可用双层平板法，首先在普通平板培养基上把样品悬浮液涂抹培养，等长出菌落后覆盖一层营养琼脂，内含3%酵母RNA，0.7%琼脂及0.1mol /L EDTA，pH7.0，于42C左右培养24h，四周产生透明圈的菌落，即为核酸分解酶产生菌。 在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行筛选。

24、在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。,产酶微生物的分离与筛选,摇瓶培养法（随机筛选）,摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。但若某些突变性状无法用简便的形态观察或平皿快速检测法等方法检测时，摇瓶培养法也可用于初筛。,产酶微生物的分离与筛选,原生质体 植物或微生物细胞去掉壁以后的内含物称原生质体。

25、原生质休融合育种是基因重组育种的一种重要方法。,2.4 产酶微生物原生质体融合育种,产酶微生物的分离与筛选,标记菌株的筛选和稳定性验证。 原生质体制备。 等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 涂布于再生培养基，再生出菌落。 选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 生产性能筛选。,2.4.1 原生质体融合程序,产酶微生物的分离与筛选,1. 标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。,2.4.2 原生质

26、体融合育种的关键,产酶微生物的分离与筛选,2. 原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。,为何不用机械破壁呢？,产酶微生物的分离与筛选,3. 影响原生质体制备的因素 菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 菌体的培养时间 为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。 酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另

27、外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。,产酶微生物的分离与筛选,酶处理温度(2040) 破壁时的pH值 渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。,产酶微生物的分离与筛选,2.4.3 原生质体的融合,原生质体融合就是把两亲本的原生质体混合在一起，在物理的(电融合)或化学的(聚乙二醇)促融作用下，诱导细胞融合。 目前在微生物菌体原生质体融合中，报道最多的是聚乙二醇(PEG)诱导融合，也有一定数量的电场诱导融合。PEG的分子量随乙二醇聚合数目不同而不同，在一定范围

28、内，分子量越大，其促融效率越高，但毒性也越大。,产酶微生物的分离与筛选,真菌融合常采用分子量40006000，动物细胞融合采用分子量1000的聚乙二醇。 融合适宜pH值为7.07.5、钙离子浓度为0.010.05M，PEG的使用浓度为35%，双亲原生质体数量应保证有107个/毫升。,原生质体融合时将两种原生质体悬液等体积混合，5000r/min离心后弃上清液，然后用巴氏吸管使其悬浮，用巴氏吸管滴入1毫升PEG，并边加入边轻轻摇动，1分钟内加完，30水浴，静止促融10分钟，离心除PEG，然后稀释融合液涂布于再生培养基上进行培养。,产酶微生物的分离与筛选,2.4.3 融合体和重组体的检出,重组融合

29、子检出方法包括直接检出法和间接检出法。 直接检出法： 根据亲本菌株的遗传标记，直接筛选出融合子。如果两亲本菌株均为营养缺陷型标记可将融合液涂布于基本培养基上，直接筛选出融合子。若为抗药性标记，可在补充二种药物的培养基上，筛选出双重抗药性的重组子。,产酶微生物的分离与筛选, 间接检出法： 即将融合液涂布在营养丰富的再生平板上，使亲本菌株和重组子都能再生，然后，再施加选择因子检出重组子。 间接法虽然费时，但它可以克服某些有表型延迟作用的遗传标记因直接选择而产生的干扰作用。,产酶微生物的分离与筛选,重组融合子拣出后，需对融合子进行进一步的。融合子的鉴定通常从以下几个方面进行综合分析： 生物学特性分析

30、（菌落形态、孢子形态及大小等）：锁状联合是食用菌种内杂交子所具有的特征，可以作为种内是否融合成功的一个标志，但作为种间融合子的标志时不完全可靠。 融合子菌株与双亲菌株在遗传物质组成上有差异，因此在对峙培养时，能产生拮抗反应，也是常用的鉴定方法。,产酶微生物的分离与筛选,融合子若能形成子实体，可对子实体特征进行鉴定以及对担孢子进行遗传分析。另外，还可对融合子菌丝体进行荧光染色，确认融合子细胞内核的数目。 生化指标分析： 主要从氨基酸、DNA百分含量及同功酶谱等方面进行分析。,产酶微生物的分离与筛选,基因工程基本操作的四个步骤：,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细

31、胞,4、目的基因的检测与鉴定,2.5 基因工程育种的基本原理,产酶微生物的分离与筛选,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,产酶微生物的分离与筛选,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库,产酶微生物的分离与筛选,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,产酶微生物的分离与筛选,2.基因文库的构建方法, 鸟枪法：,供

32、体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接 载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(直接分离法),产酶微生物的分离与筛选, 反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),产酶微生物的分离与筛选, 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,产酶微生物的分离与筛选,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物