MCAO模型的制备

1、实验前准备实验器材：干棉球、酒精棉球、75%酒精、生理盐水、注射器（1ml、2ml）、黑色记号笔、固定大鼠用粗线绳、大鼠板、染色小烧杯、标本瓶手术器械：备皮剪子1、眼科剪1、大直镊1只、小弯镊1对、（动脉夹2）、止血钳2-3、缝合线、缝合针、持针器麻醉剂：10%水合氯醛（400mg/kg）保温：60W白炽灯，于37cm高处直接照射能使肛温保持在 37栓线：直径0.24mm，头端光滑圆钝；在栓线18mm的位置用黑色记号笔标记；75%酒精清洁后置1: 2500单位肝素化生理盐水中备用。体重与栓线直径：直径0.24mm的栓线适用于体重220-280g的SD大鼠。TTC的配制：用0.2mol/L磷酸缓

2、冲液（PBS）配成2%TTC溶液（pH7.4），避光保存。药物配制：无论生理盐水还是受试药物标签均采用代号，给药及评分均采用单盲。仪器激光多普勒血流仪（Laser Doppler Flowmetry, LDF）系统，包括：PeriFlux 5001 Main Unit，PF5010 LDPM Unit（激光多普勒微血流灌注量检测单元），LD Probe 407-1（Perimed Co., Jarfalla, Sweden）；大鼠脑立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；牙科手钻（Strong 90#, Korea）；大鼠脑切片模具；荧光正置显微镜(NIKON ECLIPSE 80i, 4

3、00)及成像系统（ACT-2U NIKON Imaging System）。大脑中动脉栓塞（MCAO）模型的制备参照Zea Longa等2建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法，作适当改进。10 %水合氯醛溶液400mg/kg，腹腔注射麻醉动物。大鼠仰卧位固定，颈部正中切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露右侧颈总动脉(CCA)。分离至颈内动脉（internal carotid artery，ICA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）分叉后一段，仔细分离避免损伤迷走神经和气管，置线备用。于颈内、颈总动脉处用动脉夹夹闭，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离

4、端拉至与颈内动脉成一条直线，将尼龙线由颈外动脉插入，插入后用0号丝线结扎，以防止出血，打开颈内动脉处动脉夹，将尼龙线插入颈内动脉，继续插入至颅内，插入深度约18.50.5mm至微感阻力，使尼龙线头端通过MCA起始处，到达较细的大脑前动脉，此时即实现右侧大脑中动脉的血流阻塞，结扎ICA以固定尼龙线和防止出血，逐层缝合，尼龙线残端留l cm长于皮外。假手术组只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎及导入线栓。手术过程中室温保持在24-25，生物机能实验系统进行动物呼吸及心电监测。3局部脑血流量测定大鼠俯卧位固定于立体定位仪上，开颅窗并清理手术视野，以前囟为坐标原点，选取前囟后1-2mm、右侧2-4mm为

5、测定点9，周围直径约2-3mm 区域用牙科钻打薄，保持硬脑膜的完整并避开较大的血管，定位并固定好探头座。将动物从定位仪取下并使其仰卧位于手术台上，进行MCAO手术，当线插入ICA后先不插入颅内，稳定LDF读数后，记录5min内血流值，以其平均值作为脑血流的基础值（baseline value）。把线插入颅内，当血流值突然下降至基础值的10%-20 % 时，提示中脑动脉血流已被阻断。每组MCAO 前的血流值为本组的基础值（100），手术后血流值均以此基础值的百分率表示。4神经行为学检查Bedersons 评分动物于给药前及处死前进行神经行为学观察，参照Zea Longa的方法，提鼠尾离开地面约1

6、 尺，观察两前肢状况；将大鼠置于水平地面，推动其双肩，观察两侧抵抗力有无差异；大鼠置于地面，观察其行走情况。采用四级评分法（0-5分），分数越高，说明其神经行为损伤越严重。（1）行为完全正常者，记0分；（2）提起鼠尾离开地面，手术对侧前肢内旋、内收者，记1分；（3）大鼠至地面，用手挤压两侧检查其抗力，手术对侧抗力下降者，记2分；（4）大鼠至地面，观察其行走，围绕手术对侧转圈者，记3分；（5）损伤极其严重，已无法自主活动者，记4分。5脑梗死体积的测定：评分后大鼠断头处死，迅速将取出的脑组织置于-20冰箱，10min 后置室温环境，将脑置于大鼠脑切片模具中，切除嗅球、小脑和低位脑干后按图谱所示间隔2mm冠状切五刀，切成6个大脑连续冠状粗切片。然后迅速将脑片置于5ml含2%TTC的溶液中，37恒温、避光孵育30min，期间每隔5min将脑片翻动一次。经TTC染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照