人胚胎干细胞研究进展

1、人类胚胎干细胞的研究进展金舟学号10170807【摘要】干细胞是一种早期未分化的细胞，具有分化潜能和自我复制能力。胚胎干细胞(ES细胞)是具有发育全能性的高度未分化细胞，通过体外分化抑制培养、分离和克隆早期胚胎内部细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PGC)获得。人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破。它揭示了人类发展的过程，并可能给现代临床医学模式带来革命性的变化。本文综述了人类胚胎干细胞的起源、建立、生物学特性、应用前景和伦理问题。【关键词】胚胎干细胞；克隆；伦理、医学；概观1.胚胎干细胞的概念胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎细胞团(ICM)或桑椹胚中分离的高度未分化的全能性细胞系

2、，其可以在体外长时间培养，并且可以在合适的条件下分化成胎儿或成人的各种类型的组织细胞。胚胎干细胞是全能的干细胞。术语ESCs是根据其起源于胚胎而命名的，但是从研究的角度来看，它的概念没有一个特殊的标准。2001年，根据奥斯汀史密斯对小鼠胚胎干细胞的研究，美国国立卫生研究院总结了胚胎干细胞的一些基本特征，并对其概念提出了一系列标准1: ，来源于内细胞团或胚泡上胚层；(2)它可以无限对称分裂并保持未分化状态(长期自我更新)；显示并保持正常、完整(二倍体)和稳定的染色体核型；通用胚胎干细胞可分化为三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的所有细胞类型；在发育过程中可整合到所有胚胎组织中(体外长期培养的小鼠

3、胚胎干细胞移植到另一个胚胎中形成嵌合体动物后仍可产生所有组织)；具有克隆和形成胚胎细胞系的能力，能产生卵细胞或精细胞；基因克隆，即单个胚胎干细胞可以产生一组具有与亲代细胞相同遗传特征的细胞(克隆)；转录因子Oct- 4的表达，其反过来激活或抑制大量靶基因以维持胚胎干细胞处于未分化状态；，可被诱导继续增殖或进入分化状态；细胞周期中缺乏G1时相限制点。胚胎干细胞大多处于细胞周期的S期，在此期间发生DNA合成。与分化的体细胞不同，胚胎干细胞不需要任何外部刺激来启动DNA复制。其中，、不适用于人胚胎干细胞，、不适用于人胚胎干细胞，所有标准均适用于小鼠胚胎干细胞。2.胚胎干细胞及其“多能性”目前，获得胚

4、胎干细胞的方法主要有两种：1来源于自然胚胎，可以在胚胎发育的不同阶段获得；第二，它可以从通过细胞克隆或在胚胎发育的不同阶段获得的胚胎中获得。随着克隆技术的发展，后者显得更加容易。胚胎干细胞的多能性表现在它们的多向分化和发育潜能上。它的多能性在学术上用两个词来区分：全能性，指受精卵和胚泡细胞形成完整生物体的能力，以及它们分化为身体所有细胞类型的潜力；多能性是指来源于内部细胞团(ICM)或原始生殖细胞(也称为胚胎生殖系干细胞)的细胞或细胞系形成包括生殖系在内的所有组织类型的能力，但形成完整生物体的可能性非常小。3.胚胎干细胞研究的主要物种类型3.1目前，人类已经获得了60多种不同基因的胚胎干细胞系

5、，主要分布在美国、澳大利亚、新加坡、印度和以色列。由于超数排卵、体外受精和胚胎移植(IVF-ET)技术在辅助妊娠技术中的不断成熟及其在世界各地的迅速发展，人类胚胎干细胞的来源似乎比其他物种更容易、更丰富。同时，由于研究的直接性，引起了许多学者的关注。然而，由于法律和伦理的原因，胚胎干细胞的研究将受到许多限制。3.灵长类动物与人类关系密切，没有太多的法律和伦理限制，因此灵长类动物胚胎干细胞是目前研究最多的胚胎干细胞物种，以恒河猴和塔玛林为代表2。恒河猴与人类关系最密切，在生殖和生长过程中与人类有许多相似之处。因此，它是胚胎学研究的最佳模式。恒河猴胚胎干细胞已成为了解各种人类组织分化的良好体外模型

6、，但其生殖特征(性成熟晚、妊娠期长、单次妊娠等)却不尽相同。)限制了它的应用。作为西半球的一种灵长类动物，塔玛林并不像恒河猴那样接近人类，但它的繁殖特性已被广泛用于实验。柽柳通常是多胞胎。性成熟期只有18个月，怀孕期较短。更重要的是，柽柳素的卵巢周期可以在前列腺素的调节下同步化，前列腺素可以收集大量生长发育一致的胚胎。目前，塔马林胚胎干细胞为我们了解灵长类动物胚胎移植和母体妊娠鉴定提供了一个非常重要的模型。从恒河猴和柽柳胚胎中分离的胚胎干细胞具有一套独特的特异性标记，包括阶段特异性胚胎抗原3和4 (SSEA-3和SSEA-4)、聚合物糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81、碱性磷酸酶等。这些

7、标记物与标记人类胚胎癌细胞的表面抗原相同。这表明灵长类动物和人类在胚胎学上高度相似，而小鼠胚胎干细胞仅表达SSEA-1和碱性磷酸酶活性，表明胚胎干细胞的表面标记存在物种差异。3.3小鼠已成为哺乳动物胚胎学的主要研究对象，这是由于它在历史上的广泛应用，以及它众所周知的遗传机制和多产性。世界上最早的胚胎干细胞株首次从小鼠胚胎中分离出来。还建立和发展了分离和培养胚胎干细胞的方法。对小鼠胚胎干细胞的进一步研究有利于灵长类动物和人类胚胎干细胞研究的发展。3.4多能胚胎干细胞株也可以从其他脊椎动物如鱼、鸟、兔、猪等中分离出来。胚胎干细胞研究物种的多样性对于研究生研究对象的早期发生过程是非常必要和重要的，如

8、细胞谱系分型和重组基因印迹等。它还在基因修饰和核转移技术的研究和开发中发挥重要作用。4.胚胎干细胞的分离和增殖技术以从灵长类动物胚胎ICM中分离的灵长类动物胚胎干细胞为例3这将在下面简要描述。4.ICM分离前的准备准备小鼠原始成纤维细胞层。用30Gy 射线处理小鼠原代成纤维细胞以停止有丝分裂活性。将细胞置于用0。1%动物胶，密度为5，104个细胞/cm2。加入培养液(80% DMEM，20%胎牛血清，0.1摩尔/升22巯基乙醇和1%非必需氨基酸溶液)，并在5% CO2培养箱中培养过夜。4.2隔离ICM在排卵后6天孵育恒河猴胚泡(或排卵后8天孵育tamarin胚泡)。5% DMEM，当透明带破裂

9、时，立即将含有兔抗恒河猴脾细胞(或兔抗塔马林脾细胞)抗体的胚泡转移到DMEM，孵育30分钟，用DMEM冲洗，然后转移到豚鼠补体1333610中30分钟，用DMEM冲洗，用吸管吸取ICM中的滋养层细胞，最后将ICM植入饲养层。4.3胚胎干细胞培养和增殖种植7 10天后，将ICM来源的细胞团转移到含有0。05%胰蛋白酶处理3 5分钟，然后用吸管轻轻吹散，将细胞种植在新的培养基上。细胞集落形成后，将单个细胞分离并种植在新的培养基上，该过程重复7-7 10d。4.4胚胎干细胞的冷冻保存如果需要冷冻胚胎干细胞，最好在培养的早期进行，选择细胞形态和核型正常的细胞进行冷冻，并在液氮中长时间保存。4.5操作注

10、意事项(1)定期从分化细胞中分离未分化细胞集落，并将其种植在新的培养基上；(2)尽快转移细胞，避免细胞分裂和死亡；(3)分离细胞集落时，每个部分含有5-10个细胞，否则细胞过多会导致分化，细胞过少会导致克隆效率低下；(4)胚胎干细胞是对各种内毒素最敏感的细胞，应注意培养液和血清的质量。(5)应注意原代成纤维细胞的质量。所有没有原代成纤维细胞的胚胎干细胞将在7-10天内分化或死亡。如果原代成纤维细胞质量差，胚胎干细胞的分化就不能被有效抑制，导致培养和增殖失败。总之，胚胎干细胞的分离和培养是一项极其复杂的实验室技术。目前的培养条件不能避免胚胎干细胞的分化，胚胎干细胞的稳定性也会随着培养周期的增加而

11、下降。因此，如何改善培养条件和培养技术是胚胎干细胞研究中最重要的问题。5.人类胚胎干细胞的来源主要包括：(1)从人类胚胎胚泡期的细胞群中直接分离多能干细胞4；(2)从终止妊娠后的胎儿组织中分离多能干细胞5；(3)体细胞核移植(SCNT)。6.人类胚胎干细胞系的建立1989年，普雷伊试图从人类畸胎瘤中分离胚胎干细胞，初步证明了建立人类胚胎干细胞系的可能性。1998年，汤姆森的团队将合法获得的体外受精的人早期胚胎体外培养至胚泡期，用免疫手术去除透明带，用抗BeWO细胞的单克隆抗体作为免疫标记，去除外细胞，用35Gy射线照射小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，用DMEM胎牛血清谷氨酰胺巯基乙醇非必需氨基酸

12、作为培养基，在体外培养人胚泡中的细胞群。9-15天后，将生长的细胞团用胰酶或乙二胺四乙酸吹胀或消化，然后在小鼠滋养层细胞上继续生长。选择具有均匀未分化形态的单克隆细胞团，吹成50-100个细胞的小团，然后培养。重复这一过程，直到形成细胞系。在此期间，应在每一步观察细胞的核型，以确保它不是癌性的。此后，将细胞系吹胀或用胶原酶IV处理长时间传代。他们最终从14个胚泡中建立了5个人胚胎干细胞系：H1、H13、H14、H7和H19。这些细胞系可以在培养5-6个月后继续生长，并传递到32代6。吉尔哈特的团队使用了一种不同于汤姆森团队的方法，从5-9周流产胎儿的性腺嵴(性腺嵴)和肠系膜中分离原始干细胞，命

13、名为EG细胞。为了避免直接使用胚胎引起的伦理问题。体外培养小鼠成纤维细胞层。向培养系统中加入重组人LIF、重组人碱性成纤维细胞生长因子和磷胆碱。7 21天后，形成一个大的多细胞集落，其形态类似于小鼠胚胎干细胞或胚胎干细胞集落。经过一系列类似于汤姆森实验室的免疫组织化学和功能实验，证明已经获得了能够形成细胞系的人胚胎干细胞集落7。到目前为止，除了汤姆森、吉尔哈特和沙姆布洛特等报道的外，还没有关于人胚胎干细胞分离的成功报道。主要原因是建立人胚胎干细胞的条件尚不成熟，对人胚胎干细胞体外诱导分化的研究尚未见报道。7.胚胎干细胞的应用前景和主要问题由于其高复制能力和多向分化潜能，胚胎干细胞显示出良好的研

14、究和应用前景。例如，将特别改变的基因转移到胚胎干细胞中，在体外选择后将胚胎干细胞引入体内，并将胚胎干细胞中的遗传信息传递给后代，可能有助于克服出生缺陷和纠正某些遗传疾病8；将遗传修饰的胚胎干细胞或胚胎干细胞与正常细胞一起形成嵌合体，并研究发育过程中细胞间相互作用对细胞突变的影响9；在胚胎干细胞或胚胎干细胞中敲除一个基因或导入一个外源基因，研究特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿瘤形成的影响1012。最近，RNAi被用于减少hES细胞中基因的表达，并获得了相对稳定的结果13。科学家认为，通过这种方法可以建立免疫无反应的hES细胞系，从而控制hES细胞移植后的排斥反应，使hES细胞移植容易成功。人类胚

15、胎干细胞的研究有望为一些临床难治性疾病提供新的治疗方法甚至治愈的可能性。例如，体外hES分化诱导的心肌细胞可被引入心室壁以替代梗塞的心肌功能14；体外分化胰岛细胞治疗1型糖尿病：用神经细胞前体细胞的诱导分化治疗帕金森病。有人预测，在未来，体外胚胎干细胞形成的器官可以用来替代体内衰竭的器官，为器官移植提供重要的来源保障。当然，要实现胚胎干细胞：的临床应用还有许多工作要做。需要进行研究以阐明胚胎干细胞的基因组印刷状态。基因组印记是一些等位基因的表观遗传修饰，与胎儿发育不良和肿瘤生长有关。在个体发育的不同阶段，基因组印记的状态是不同的。先前的研究表明，小鼠胚胎干细胞的基因组印记是异常的或不稳定的。然而，另一组研究人员发现人和小鼠EG细胞的基因组印记基本正常，这可能消除了胚胎干细胞临床应用的主要障碍。然而，关于hES细胞的研究还没有报道。免疫排斥问题亟待解决。研究表明，hES和hEG细胞移植比其他同种异体组织和器官移植有更少的排斥反应，但这是不可避免的。供体和受体ABO血型抗原、HLA组织相容性抗原和微小组织相容性复合体MHC之间的差异导致排斥反应。参考1鲁思柯尔施泰因，兰娜希尔波尔.科学进步与未来研究方向J.干细胞。2001。2汤姆森贾，马歇尔与灵长类胚胎干细胞，发育生物学的当前观点，38 :13321。3汤姆森贾，伊