双荧光素酶报告实验

1、,专业,【双荧光素酶报告实验】,目录,目录,实验原理,实验步骤,参考案例,1,目录,目录,实验原理,实验步骤,参考案例,2,01,实验原理,1,2,实验简介,实验原理,3,实验结果图,3,介绍：是通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋白（fireflyluciferase）的3UTR。,优点：蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译后立即产生报告活性，检测快速；光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。,应用：靶向结合关系验证,实验简介,4,对象：一般用HEK-293T细胞，也可使用实验中相应的肿瘤细胞。,双荧光素酶报告实验原理,5,当我们感兴趣的miRNA和质粒中的

2、插入序列结合后，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终造成荧光值的下降。海肾素荧光蛋（renillaluciferase）是作为内参来去除组间的转染效率差异的。其实你也可以理解为：用荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。,6,双荧光素酶报告实验结果,与NCmimic组比较，CELF2野生型3UTR的荧光素酶活性被miR-451显著抑制(P0.05)。说明miR-451能特异结合CELF2-3UTR并在转录后水平下调CELF2基因表达。,目录,目录,实验原理,参考案例,实验步骤,7,02,实验步骤,1,2,大致流程,重点步骤,3,注意事项,8,构建含调控元件序列的荧

3、光酶报告基因载体,筛选阳性克隆，测序,提取重组萤火虫荧光素酶报告基因载体,转染宿主细胞检测报告基因荧光强度,大致流程,9,重点步骤,10,1构建载体,2共转染,3检测荧光素酶活性,分别构建靶基因双荧光素酶报告基因载体以及与目标分子结合位点突变的突变体。,将两种报告质粒、过表达质粒以及阴性对照质粒分别共转染至细胞中，转染24h后裂解细胞，12000rpm离心1min，收集上清。,每个细胞样品中加入100L萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素，加入100L海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶，实验重复3次。,载体,萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体。海肾荧光素酶建

4、议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。载体比例根据实验具体情况调整。,细胞,反应,细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。,双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差。,注意事项,11,目录,目录,实验原理,实验步骤,参考案例,12,03,参考案例,1,2,案例一,案例二,13,案例一,14,分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-CADM1W

5、T和PGLO-CADM1MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XXmimic和阴性对照质粒分别共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24h后裂解细胞，12000rpm离心1min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-LuciferaseReporterAssaySystem，E1910，Promega)检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100L萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶(Firelylueiferase)，加入100L海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶(Renillalueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。,案例一,

6、15,分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-CADM1WT和PGLO-CADM1MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XXmimic和阴性对照质粒分别共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24h后裂解细胞，12000rpm离心1min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-LuciferaseReporterAssaySystem，E1910，Promega)检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100L萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶(Firelylueiferase)，加入100L海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶(

7、Renillalueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。,Step1：构建载体,案例一,16,分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-CADM1WT和PGLO-CADM1MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XXmimic和阴性对照质粒分别共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24h后裂解细胞，12000rpm离心1min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-LuciferaseReporterAssaySystem，E1910，Promega)检测荧光素酶活性。每个细胞样品中

8、加入100L萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶(Firelylueiferase)，加入100L海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶(Renillalueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。,Step2：共转染Tip：此处使用的是实验中相应的肿瘤细胞,案例一,18,分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-CADM1WT和PGLO-CADM1MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX和阴性对照质粒分别共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24h后裂解细胞，12000rpm离心1min，收集上清

9、。使用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-LuciferaseReporterAssaySystem，E1910，Promega)检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100L萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶(Firelylueiferase)，加入100L海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶(Renillalueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。,Step3：检测荧光素酶活性,案例二,19,生物信息学进行LINC01082和miR-XX结合关系的分析，利用荧光素酶报告法验证miR-XX是LINC01082的直接靶点，人工合成LINC010

10、82基因片段利用内切酶位点SpeI和HindIII引入pMIR-reporter(北京华越洋生物科技有限公司)中，在LINC01082野生型上设计种子序列的互补序列突变位点，通过限制性内切酶酶切后使用T4DNA连接酶将目的片段插入到pMIR-reporter报告质粒中。将测序正确的荧光素酶报告质粒WT和MUT分别与miR-XX共转染至细胞HEK-293T(上海北诺生物科技有限公司)中。转染48h后收集并裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒(K801-200，Biovision公司)Glomax20/20luminometer荧光检测仪(Promega公司)检测荧光素酶活性，每组实验重复三次。,案例二,20,生物信息学进行LINC01082和miR-XX结合关系的分析，利用荧光素酶报告法验证miR-XX是LINC01082的直接靶点，人工合成LINC01082基因片段利用内切酶位点SpeI和HindIII引入pMIR-reporter(北京华越洋生物科技有限公司)中，在LINC01082野生型上设计种子序列的互补序列突变位点，通过限制性内切酶酶切后使用T4DNA连接酶将目的片段插入到pMIR-reporter报告质粒中。将测序正确的荧光素酶报告质粒WT和MUT分别与miR-XX共转染至细胞HE