DB12-T1292-2023-花椰菜主要流行病害抗性鉴定技术规程-天津市

ICS65.020.20CCSB3112天津市地方标准DB12/T1292—2023花椰菜主要流行病害抗性鉴定技术规程Technicalstandardsforidentificationofresistancetoimportantepidemicdiseasesincauliflower天津市市场监督管理委员会发布DB12/T1292—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。本文件起草单位：天津科润农业科技股份有限公司、天津市农业科学院。本文件主要起草人：孙德岭、姚星伟、张小丽、牛国保、单晓政、文正华、刘莉莉、江汉民。IDB12/T1292—2023花椰菜主要流行病害抗性鉴定技术规程1范围本文件规定了花椰菜主要流行病害抗性鉴定的试剂、仪器设备、病原菌接种体制备、病原菌接种方法、病情调查、群体抗病性评价、鉴定记载等的要求。本文件适用于花椰菜主要流行病害抗性鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。44.1BL培养基葡萄糖10.0g，肉膏3.0g，肝浸出液150.0ml，植胨3.0g，L-半胱氨酸·HCL0.5g，朊蛋白胨10.0g，可溶性淀粉0.5g，吐温801.0g，胰酪胨5.0g，酵母膏5.0g，溶液A（25gKH2PO4、35gK2HPO4溶于蒸馏水并定溶至250ml）10.0ml，溶液B（0.5gFeSO4·7H2O、10.0gMgSO4·7H20、0.337gMnSO4·2H2O和0.5gNaCl溶于蒸馏水并定容至250ml）5.0ml，琼脂15.08g，加蒸馏水至1000ml。pH值调至7.2，高温灭菌后备用。4.2量取500ml水，加入玉米粉30g，保持温度在60℃左右约1h，用纱布过滤后，加入适量的水补足500ml。另取500ml水，加入琼脂17g，加热使之慢慢融化，过滤后补足水至500ml。两液混合后分装，高温灭菌后备用。玉米粒煮熟煮熟，高温灭菌4.370%乙醇溶液51DB12/T1292—20235.15.25.35.45.55.65.75.85.9恒温摇床回旋频率范围：40r/min～300r/min；温度控制范围：5℃～60℃。恒温培养箱温度范围：0℃～℃0℃；温度波动范围：±0.5℃。低温冰柜箱内温度：-15℃～-25℃。灭菌锅温度范围：0℃～135℃；灭菌时间：4min～120min；最高工作压力：0.22MPa。超净工作台洁净等级：100级@≥0.5µ；平均风速：0.25m/s～0.6m/s。电子天平感量0.01g。血球计数板规格16×25或者25×16。离心机物镜倍数：10×、20×、50×、100×；目镜倍数10×。66.1从花椰菜黑腐病样采用常规组织分离法分离病原菌，并对分离物进行鉴定，采用单孢分离法进行分离纯化，经柯赫（Koch）法则回接验证后，保存备用。接种前将供试菌株转接于BL液体培养基上，置于28℃摇床恒温培养1天后取出，加入适量无菌水稀释，用血球计数板调整菌液浓度至1×10CFU/ml，置8于4℃冰箱保存备用。6.2采集花椰菜霜霉病病叶表面着生的霉层及其附着物用无菌水冲净，再用无菌水冲洗3遍，将洗净的病叶放入无菌培养皿中置于温度20℃、相对湿度95%的培养箱中黑暗培养1d。之后用湿棉球将新产生的孢子囊轻轻剥落于无菌水中制成悬浮液，通过显微镜观察其孢子形态进行病原菌鉴定，利用血球计数板6.32DB12/T1292—2023从花椰菜菌核病样采用常规组织分离法分离病原菌，采用单孢分离法进行分离纯化，经柯赫（Koch）法则回接验证后，保存备用。接种前将菌株置于22℃培养箱中培养3天～4天至长出白色菌丝进行活化，用灭菌的5mm打孔器制备接种用菌饼备用。6.4黑斑病菌接种体制备从花椰菜黑斑病样采用常规组织分离法分离病原菌，采用单孢分离法进行分离纯化，经柯赫（Koch）法则回接验证后，保存备用。接种前将菌株转接到玉米粒培养基，置于25℃，培养15天，取出光照4h，用双层无菌纱布保湿48h，用无菌水洗刷孢子浓度至1×10CFU/ml，置于4℃冰箱保存备用。66.5根肿病病菌接种体制备将新鲜的花椰菜肿根取500g搅碎，4层纱布过滤，2500r/min离心5min，弃上清液；用无菌水悬浮沉淀，重复3次，用血球计数板统计接种液浓度至1×10CFU/ml，置于4℃冰箱保存备用。67室内接种鉴定7.1鉴定室人工接种鉴定室可以选择能进行温湿度及光照调控的人工气候室或气候箱。7.27.3鉴定设计鉴定材料随机排列，每份材料重复3次，每个重复10株苗。鉴定材料育苗鉴定种子在1%次氯酸钠溶液中浸泡10min，清水冲洗后置于25℃恒温培养箱内催芽或直接播种于育苗盘内。装入准备好的育苗基质土，防虫网内或日光温室内育苗，室内温度白天控制在22℃～25℃，夜晚控制在17℃～20℃，待幼苗长至4片～5片真叶时进行抗病性鉴定。88.1采用喷雾方法接种。待花椰菜幼苗长至4片～5片真叶时，移到人工气候室内保湿一夜，使其叶缘出现露珠，第二天制备接种菌液并用小型喷雾器进行喷雾接种，均匀喷施至叶片上，在人工气候室内24h相对湿度95%～100%，24h后降低相对湿度至80%～85%，28℃，14h光照，7天后调查记载发病情况。8.2采用喷雾法接种。将菌液倒入小型喷雾器中，在接种材料的叶片背面喷洒，每株100µL。接种后将温度控制在18℃～25℃，黑暗条件下相对湿度95%～100%保湿24h，24h后降低相对湿度至80%～85%，25℃，14h光照，7天后进行发病情况调查。8.3采用贴菌片接种。当花椰菜幼苗4片～5片真叶时移到人工气候箱内保湿过夜，使其叶面湿润，将直径5mm菌片带菌丝面贴于幼苗的第3片真叶，用保鲜膜保湿，接种后24h保持在20℃～23℃，相对湿度95%～100%，24h后降低相对湿度至80%～85%，7天后进行病害调查。3DB12/T1292—20238.4黑斑病接种采用喷雾法接种，将制备好的孢子悬液均匀喷洒于幼苗叶片表面，每株100µL。接种后将温度控制在20℃左右，黑暗条件下相对湿度95%～100%，24h后降低相对湿度至80%～85%，25℃，14h光照，7天后进行发病情况调查。8.5根肿病接种采用伤根灌菌法。取4片～5片真叶的花椰菜幼苗，在幼苗根部一侧用灭菌刀片将部分根轻轻划伤，给根系造成机械伤害，将1×10CFU/ml接种菌液5ml灌入伤根部位。接种6周后进行发病情况调查。89病情调查9.1病情级别花椰菜主要流行病害病情级别划分见表1。表1花椰菜主要流行病害病情级别划分病情级别黑腐病无病症霜霉病无病症菌核病无病症黑斑病无病症根肿病无病症01级水孔处有黑色枯死点，无扩展接种点上有稀疏病斑，不扩散病斑仅出现在接病斑面积占整个种点处，无扩展叶面积5%以下根肿只附着在侧根，数量占根系全部的1%～10%3级5级7级9级病斑从水孔向外扩展，占叶面积5%以下叶片有较多病斑，所属凹陷，叶片背面无霉层发病叶片病斑面病斑面积占整个积占叶片面积的叶面积5%～10%10%以下主根有根肿附着，侧根上根肿数量占10%～25%以上发病叶片病斑面病斑面积占整个根肿数量占25%～50%，主根有附着积占叶片面积的叶面积11%～20%10%～30%病斑从水孔向外病斑面积达50%～发病叶片病斑面病斑面积占整个根肿数量占51%～75%，主根有附着积占叶片面积的叶面积21%～50%31%～50%病斑从水孔向外病斑面积70%以上，发病叶片病斑面病斑面积占整个根肿数量占75%以上，扩展，占叶面积积占叶片面积的叶面积50%以上50%以上50%以上9.2调查每份鉴定材料接种叶片或根系发病情况，根据病害症状描述，逐份材料进行调查，记载接种病······································································(1)×4DB12/T1292—202310群体抗病性评价10.1抗病性评价标准花椰菜主要流行病害抗性鉴定评价标准见表2。表2花椰菜主要流行病害抗性评价标准病情级别黑腐病霜霉病菌核病黑斑病根肿病免疫（I）DI=0.00DI=0.00DI=0.00DI=0.00DI=0.00高抗（HR）0＜DI≤11.11抗病（R）11.11＜DI≤33.33中抗（MR）33.33＜DI≤55.55感病（S）55.55＜DI≤67.77高感（HS）DI＞67.770＜DI≤11.1111.11＜DI≤33.3333.33＜DI≤55.5555.55＜DI≤77.77ID＞77.770＜DI≤55＜DI≤2020＜DI≤4040＜DI≤70ID＞700＜DI≤1515＜DI≤3030＜DI≤4545＜DI≤70DI＞700＜DI≤12.512.5＜DI≤2525＜DI≤4545＜DI≤65DI＞6510.2有效性判别感病对照材料达到其感病程度，抗病对照材料与实际抗性程度相符，该批次抗病鉴定结果视为有效。鉴定材