植物组织培养-植物组织培养的基本原理

1.1植物细胞的全能性植物细胞全能性（totipotency）：是指任何携带完整遗传信息的植物活细胞都具有表达其所有遗传信息的能力，能够发育成完整的植株。全能性是一种可能性，变为现实必须满足两个条件：解除抑制和给予刺激。细胞需经过脱分化和再分化过程才能表现其全能性。1植物组织培养的基本原理1.2植物细胞的分化与脱分化脱分化（dedifferentiation）：成熟细胞或分化细胞转变为分生状态（即形成愈伤组织）的过程。再分化（redifferentiation）：成熟细胞或分化细胞脱分化转变为愈伤组织后重新分化成异质细胞的过程。1.3植物的形态建成

1.3.1愈伤组织的诱导、生长和保持伤口可能导致愈伤组织的形成。愈伤组织形成可以在几乎所有的活的植物中发现。伤口愈伤组织的开始是植物的一种自我保护反应；内源植物激素水平的改变，结果使细胞分裂具有活性。机械损伤、微生物入侵以及昆虫的袭击也可以导致愈伤组织产生。Woundcallusonthestem

ofanErythrinatree1.3.1.1愈伤组织的诱导愈伤组织起源于母体组织增殖细胞。在培养时，通过把全植株的一小部分（外植体）在无菌条件下放到支持生长的培养基上来产生愈伤组织。激素改变了细胞的代谢使之从静止转变为具有活性。来自于叶组织来源于根来源于维管组织来源于胚组织培养条件固体培养基暗培养液体培养基的缺点污染损失大不利于气体交换，影响愈伤组织形成。诱导期（启动期）细胞准备分裂。因植物种类和外植体状况而异。对大多数植物，愈伤组织建立相对比较容易；如双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、蕨类植物以及苔藓等。来自多种器官的组织在适当的培养基上可能都有分裂和增生扩散的潜能，然而，某些组织似乎比另一些更倾向于使细胞快速分裂。一般需要1天到几天。1.3.1.2愈伤组织的生长诱导期后，外植体外层细胞开始分裂，在组织受伤表面形成一种创伤形成层，愈伤组织的细胞数目迅速增加。特点：细胞分裂速率大大超过细胞伸长速率，单个细胞的平均重量下降，体积变小。如菊芋外植体培养7d后，细胞数目增加10倍以上，鲜重仅增加1倍。愈伤组织类型质地：松脆、致密高生长素：致密变松脆。低或无生长素或高细胞分裂素：松脆变致密。

颜色：白色、黄色、绿色、红色1.3.1.3愈伤组织的保持一段时间后，由于基本培养物的损耗、凝胶的干燥以及代谢物的积累，需要将愈伤组织转到新鲜的培养基上进行继代培养。愈伤组织继代培养时要有适当的大小，以保证在新鲜培养基上可以重建生长。通常每3～6周进行继代培养。Typicalcallusgrowthcurve.Xindicatestimeforsubculture大多数情况下，随继代培养代数的增加和培养时间的延长，愈伤组织出现生长势下降、褐变、分化和形态发生能力逐渐降低甚至死亡或发生能力完全丧失。遗传因素：染色体畸变、基因突变。生理因素：细胞内激素平衡或细胞对外源生长物质的敏感性发生改变。延长培养期可能使愈伤组织对生长素的需求发生变化，导致生长素的自给或自养，出现驯化现象。一般1年以上或10代以上出现。生理因素导致的形态发生能力下降可通过改变培养条件而恢复。1.3.2愈伤组织再分化愈伤组织生长过程中，开始细胞分裂局限在外层细胞，当表面细胞分裂逐渐减慢并停止时，内部较深处的细胞才开始分裂，且分裂的方向也发生改变，形成了维管化组织和瘤状结构，这是愈伤组织生长的一个共同特征。很多情况下，它们往往变成生长中心，但不进一步分化，并从它们的周围产生薄壁细胞，结果形成一种“泡沫球”增殖物，这仍然是生长活跃的愈伤组织的特点。随后这些小疣状物可以经历另一个发育过程，出现器官分化和体细胞胚状体的发生。在愈伤组织的培养过程中细胞分化的程度和类型有相当大的可变性。很难找到由完全一致的实质细胞组成的均一的愈伤组织。当形成导管元件、筛管元件、栓化细胞、分泌细胞等时就发生了细胞分化。一些分裂的细胞形成拟分生组织或维管节结，以后它们将变成芽顶点、根原基或初始胚形成的中心。xylemtissuemeristematicactivityunorganisedtissue再分化途径器官发生途径：愈伤组织先产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），然后形成完整植株。胚状体发生途径：愈伤组织形成胚状体，再在另一种培养基上同时发展成带有根的苗。也叫无性胚胎发生（无性系）。胚状体是指愈伤组织中形成的与种子中胚相似的具有苗端和根端的双极性结构。也叫体细胞胚。1.3.2.1器官发生先形成芽，后在芽基部长根。先形成根，后在根基部形成芽。在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后根、芽的维管束接通形成完整植株。仅形成芽或根。如茶树花粉愈伤组织往往只能形成根。Shoot(caulogenesis)(a)androotdevelopment(b&c)oncallusofHypoxis1.3.2.2体细胞胚胎发生起源：合子胚是配子细胞融合的产物，即受精卵；对体细胞胚而言（合成的无性胚）融合是不需要的。形态：一个完全发育的胚是具有两极的轴，一端是芽分裂组织，另一端是根分裂组织；也可以根据一种特殊类型的叶片——子叶来辨别。进化：胚胎发育有连续的典型形态阶段（球形胚、心形胚和鱼雷胚）。体细胞胚胎的特征：体胚最根本的特征是具有两极性。即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单向极性。体胚的维管组织与外植体的该组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往住总与愈伤组织的维管组织联系。体胚的维管组织的分布是独立的Y字形，而不定芽的维管组织则无此现象。Typicalmorphologicalstagesduringembryodevelopment:(A)globular,(B)heartshaped,(C)torpedo体胚发生的方式体胚发生的方式分为直接发生和间接发生两类。直接发生是指体胚直接从原外植体的胚性细胞不经愈伤组织阶段发育而成；而间接发生是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成。多数体胚是间接发生。直接发生胚性细胞：与分生组织细胞类似，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚，可直接发育成体细胞胚胎。如柑橘的珠心组织、茶树和龙眼的子叶、香雪兰的花序等外植体。间接发生胚胎发生丛（EC）的形成：EC是愈伤组织中一种液泡小、胞质浓的小细胞聚集成的丛状结构。其表面是高度分生组织化的细胞团，每个表面细胞都可能发育成胚状体。EC原培养基上不能使其表面的胚状体发育，但可增殖、崩溃而不衰。EC在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体的发育。人工种子合成或人工种子是独立包埋的体细胞胚。通常术语“embling”用来描述从人工种子发育而来的植株。通常用海藻酸钠作为人工种子的包埋剂。也发展了用新的自裂胶珠的方法。直到现在人工种子的质量和保真度仍然是人工种子产品发展和大量生产的制约因素。1.4植物组织培养的基本程序无菌外植体的获得初代培养物的建立形态发生和植株再生培养产物的观察记载1.4.1无菌外植体的获得外植体携带有各种微生物，这些微生物一旦进入培养容器，会造成培养基和培养材料污染，实验无法进行。所以，污染是组织培养的一大障碍，需要利用各种灭菌剂进行外植体的灭菌。不同器官的灭菌方法茎尖、茎段、叶片根、块茎、鳞茎花蕾果实、种子1、茎尖、茎段、叶片的灭菌清水冲洗（茸毛较多的先用皂液洗涤），吸水纸吸干。0.1％～0.2％氯化汞浸泡2～10min；或70％酒精浸数秒，再在10％次氯酸钙浸泡5～20min（或2％15～30min）。无菌水冲洗3～5次，吸干。适当切块，接种。2、根、块茎、鳞茎的灭菌带土，易损伤。仔细刷洗，切除损伤部位，增加灭菌时间或浓度。0.1％～0.2％氯化汞浸泡5～12min；或70％酒精浸数秒，再在6～10％次氯酸钙浸泡5～20min。3、花蕾的灭菌花蕾中的花药处于无菌状态，采摘后可直接灭菌。70％酒精浸10～30s，

0.1％氯化汞浸泡3～10min（或1％次氯酸钙10～20min）。4、果实、种子的灭菌有些表面具茸毛或蜡质，需加吐温-80。果实：70％酒精浸数秒，2％次氯酸钙10～20min。种子：0.1～0.2％氯化汞浸泡5～10min（或10％次氯酸钙20～30min）。1.4.2初代培养物的建立无菌环境：外植体、培养基、接种器械、接种工作台。规范操作：无菌操作合适条件：培养基、激素、其他添加物、外植体、培养条件等。抗生素的使用外植体灭菌是表面灭菌，无法除去侵入组织内部的微生物。有时可以考虑在培养基中加入抗生素。抗生素对植物生长可能有抑制作用，需摸索其合适的种类和浓度。注意添加方式，一般不能高压灭菌，有些需要过滤除菌。1.4.3形态发生和植株再生

体细胞胚植株外植体（愈伤组织）具根、茎的两极器官植株器官分化单极器官先茎后根植株先根后茎植株1.4.4培养产物的观察记载愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织的外植体数/外植体总数*100％胚状体诱导率＝产生胚状体的外植体数/外植体总数*100％芽分化率＝产生芽的外植体数/外植体总数*100％发根率＝发根芽数/培养芽数复习思考题：简述植物细胞全能性的概念。什么是植物细胞脱分化和再分化？愈伤组织是如何形成和生长的？植物离体培养中再生植株有哪些途径？何谓植物体细胞胚胎？其发生有哪些途径？影响植物离体形态发生的因素有哪些？为什么愈伤组织诱导一般选用固体培养基？愈伤组织的形成时期及特点。简述继代培养的原因及要点。体细胞胚胎的特征及发生方式。4植物器官培养植物器官培养是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。根、茎、叶、花器、果实、种子。4.1根的培养根系生理代谢研究的良好实验体系；研究器官分化、形态建成的良好体系；建立根无性系，用于制药；诱变育种。4.1.1离体根的培养方法固体培养法：平放液体培养法：振荡固体－液体双层培养法：根段形态学上端插入固体培养基，下端朝上浸露在液体培养基中。其他特殊方法4.1.2离体根所用培养基WhiteMS、B5等大量元素减半或减2/34.1.3影响离体根生长因素基因型营养条件：氮源、碳源、微量元素、维生素B1激素：生长素pH光照和温度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1茎段培养植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。4.2茎段和茎尖培养茎段培养的目的进行植物的离体快速繁殖。研究茎细胞的分裂潜力和全能性。诱导细胞变异和突变体的获得。茎段培养的特点和优点特点：以芽生芽的方法进行增殖。优点：容易成功、变异小、性状均一、繁殖速度快。茎段培养产物单苗（芽）丛生苗（芽）单生芽和丛生芽的增殖方式适宜植物的离体快速繁殖。完整植物愈伤组织影响因素基因型激素配比：生长素、细胞分裂素4.2.2茎尖培养茎尖培养（shoottipcultureorapicalmeristemculture）是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。材料茎尖分生组织培养：<1mm(带有1－2个叶原基的生长锥），可去毒。普通茎尖培养：几毫米至几十毫米的茎尖、芽尖及侧芽培养。Shoottipculture

茎尖培养的一般方法材料制备：精心预处理严格灭菌小心取材：体视显微镜、解剖针茎尖培养注意事项取材大小：脱毒小于1mm，快繁可数毫米。茎尖微小趋向于形成愈伤组织。培养基：多为MS，避免2,4-D（促使外植体愈伤组织化）。茎尖分生组织培养与脱毒普通茎尖培养与繁殖技术无菌物的建立芽的增殖中间繁殖体的增殖诱导生根移栽概念：Micropropagation生长状态及原因生长太慢：茎尖不见明显增大，但颜色转绿。进入休眠生长素太低温度低生长过旺：茎尖明显增大，基部产生愈伤组织，茎尖难于伸长，色泽较淡。生长素偏高用了2,4-D光照太弱温度过高生长正常：茎尖逐渐转绿，基本逐渐膨大，有时形成少量愈伤组织，茎尖逐渐伸长，最终形成小枝。影响茎尖微繁的因素基因型外植体的大小供试植株的生理状态芽的着生部位褐变玻璃化极性后生变化形态发生能力遗传稳定性4.3叶