广西《老鼠簕质量控制技术规程》编制说明

广西地方标准《老鼠簕质量控制技术规程》（征求意见稿）编制说明一、项目来源根据《关于下达2016年第六批广西地方标准制定（修订）项目计划的通知》（桂质监函〔2016〕324号）文件精神，由广西中医药大学提出，由广西中医药大学起草广西地方标准《老鼠簕质量控制技术规程》（项目编号为2016-06066）。二、项目背景及目的意义老鼠簕（AcanthusilicifoliusL）是爵床科老鼠簕属的植物，分布在我国广西、福建、海南、广东等地的潮汐能地带、海岸或海滨地带，具有多种实用价值，除了是传统海洋中药外，还可用于环保、食品、饲料等行业，市场远景广阔。因此，为了更好地保护和应用这一植物资源，提高其质量和创汇能力，促进其推广应用，我们提出了制定《老鼠簕质量控制技术规程》的建议。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组本项目实行在项目主持人负责下的小组负责制，各个实施单位指定研究小组组长和成员后，对项目任务进行分解和分配，明确各小组的责任、项目实施计划，对小组成员的职责和进度进行细化，确保项目高效如期进行。在标准项目下达后及时成立了以广西中医药大学侯小涛教授主持，邓家刚、郝二伟、杜正彩、秦健峰为参与成员的标准编制小组，及时部署了标准编制的工作方案和时间进度表。在标准起草前，研究了老鼠簕的相关文献资料，并对课题研究成果进行了全面整理和总结讨论。在编制过程中，还深入广西各大主要产区广泛资源调查，同时咨询了相关权威专家，力争编制工作过程科学、严谨，方法、技术路线正确。（二）收集整理文献资料以及前期工作基础迄今为止，标准起草小组成员对老鼠簕相关研究进行了大量的文献收集以及进行了一系列药效筛选及化学成分的初步研究。迄今为止，标准起草小组成员对老鼠簕相关研究进行了大量的文献收集以及进行了一系列药效筛选及化学成分的初步研究。国内外的研究表明，老鼠簕植物中含有多糖、生物碱、黄酮、萜类和甾体、饱和直链和支链烃、脂肪酸酯类等化合物。老鼠簕具有抗氧化和肝保护作用、抗肿瘤活性、抗炎活性等多方面的药理活性。结合化学成分预实验，对老鼠簕进行了含量测定的研究。（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料以及前期研究基础进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准该部分的主体内容确定为范围、规范性引用文件、术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。（四）调研及形成征求意见稿在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关老鼠簕质量标准的要求，并结合广西老鼠簕质量控制实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成广西地方标准《老鼠簕质量控制技术规程》（草案）。2016年7月，广西地方标准《老鼠簕质量控制技术规程》获自治区质监局批准立项。2016年8月-12月，标准编制工作组组织部门有关专家征求广西地方标准《老鼠簕质量控制技术规程》（草案）意见。2017年1月-2018年12月，标准编制工作组按照专家意见进行标准的完善。2019年1月-12月，标准编制工作组在南宁市组织全区相关领域专家对广西地方标准《老鼠簕质量控制技术规程》进行征求意见。经过多次讨论、研究，最终形成广西地方标准《老鼠簕质量控制技术规程》（征求意见稿）和编制说明。四、标准主要章节内容及确定依据（一）标准涉及的技术原理及依据采用现代分析技术对老鼠勒的感官指标、理化指标进行分析测定，对老鼠簕进行质量控制是本标准制定的出发点。水分的测定：按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0832中第二法的规定测定。总灰分的测定：按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则2303的规定测定。浸出物的测定：按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则2201的规定测定，用20%乙醇溶液作溶剂。2-苯并噁唑啉酮的含量测定：采用高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0512）测定。（二）、标准涉及技术的具体实施方案按照广西壮族自治区市场监督管理局关于标准编制工作的要求，标准起草小组成员于项目实施期间，深入广西钦州、北海、防城港等地区开展资源调查、样品采集。1、水分含量测定取供试品2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，开启瓶盖在105°C干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（％)。结果：根含水量7.57%；茎含水量8.39%；叶含水量8.64%。2、浸出物的含量测定供试品粉碎，过60目筛，并混合均匀。取供试品约4g，精密称定，置250ml的锥形瓶中，精密加乙醇100ml，密塞，冷浸，前6小时内时时振摇，再静置18小时，用干燥滤器迅速滤过，精密量取续滤液20ml,置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量。结果：根浸出物含量为2.05%；茎浸出物含量为2.35%；叶浸出物含量为3.21%。3、总灰分的测定取固体试样3~5g（粉碎过2号筛），加入恒重的坩埚内，准确称量（精确至0.0001g），先以小火加热使样品先炭化至无烟，然后至高温炉中，在500℃～600℃炽灼约4h，冷却至200℃以下后取出放入干燥器中冷却0.5h。若炭化不完全，加热水或者10%硝酸铵溶液2mL，使残渣湿润、蒸干，继续按上述步骤炽灼，至内容物完全炭化。总灰分=（残渣及坩埚重量-空坩埚重量）/样品重量×100%。结果：根总灰分为13.35%；茎总灰分为12.93%；叶总灰分为13.21%。4、2-苯并噁唑啉酮含量测定4.1色谱条件：SHIMADZU（Pak-C18）色谱柱（5mm，4.6mm×250mm），流动相：(A)乙腈-(B)水（30∶70）；流速1.0mL/min；检测波长：270nm，柱温：25℃；进样量10mL。4.2对照品溶液的制备精密称取干燥的2-苯并噁唑啉酮对照品2.4mg，用色谱甲醇定容至25mL容量瓶中，溶解、摇匀，备用。4.3老鼠簕提取单因素考察提取溶剂的选择精密称定三份老鼠簕药材粉末2g，置于100ml烧瓶中，分别加15倍量的蒸馏水、甲醇、乙醇，59℃条件下水浴回流2.5h，提取2次，趁热过滤，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，抽滤转入10ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度摇匀备用。过0.45mm微孔滤膜，按4.1项下拟定条件进行分析测定，记录数据见表1。结果：当提取溶剂为甲醇时，提取效果最佳。表1提取溶剂提取率（%）甲醇0.0227乙醇0.0218水0.0208提取方法的选择精密称定4份老鼠簕药材粉末2g，1份置于100ml烧瓶中，加15倍量的甲醇，59℃水浴回流2.5h，提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，抽滤转入10ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度摇匀备用；另3份置于100ml锥形瓶中，加15倍量甲醇，分别于59℃条件下超声提取20，30，45min（功率500W40kHz），提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，抽滤转入10ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度摇匀备用。测定含量，记录数据见表2。结果：采用回流法时，提取效果最佳。表2提取方法提取率（%）回流法0.0227超声20min0.0175超声30min0.0184超声45min0.0174醇浓度的选择精密称定10份老鼠簕药材粉末2g，置于100ml烧瓶中，分别加15倍量浓度为10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%甲醇，59℃水浴回流2.5h，提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，抽滤转入10ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度摇匀备用。测定含量，记录数据见表3。结果：采用20%甲醇时，提取效果最佳。表3醇浓度提取率（%）10%0.025120%0.028530%0.027840%0.025250%0.023260%0.027770%0.024280%0.022590%0.0196100%0.0229提取时间的选择精密称定5份老鼠簕药材粉末2g，置于100ml烧瓶中，加15倍量20%甲醇，分别于59℃水浴回流0.5h，1.0h，1.5h，2h，2.5h，提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，抽滤转入10ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度摇匀备用。测定含量，记录数据见表4。结果：提取时间为1.5h时，效果最佳。表4提取时间（h）提取率（%）0.50.02151.00.02511.50.03352.00.03022.50.0302提取次数的选择精密称定5份老鼠簕药材粉末2g，置于100ml烧瓶中，加15倍量20%甲醇，于59℃水浴回流1.5h，提取次数分别为1，2，3，4，5次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，抽滤转入10ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度摇匀备用。测定含量，记录数据见表5。结果：提取4次效果最佳。表5提取次数提取率（%）10.025920.030330.032940.039250.0392料液比的选择精密称定5份老鼠簕药材粉末2g，置于100ml烧瓶中，分别加9，11，13，15，17倍量20%甲醇，59℃水浴回流1.5h，提取4次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，抽滤转入10ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度摇匀备用。测定含量，记录数据见表6。结果：选择13倍量提取溶剂效果最佳。表6料液比提取率（%）1:90.03711:110.03911:130.04081:150.04071:170.0407提取温度的选择精密称定5份老鼠簕药材粉末2g，置于100ml烧瓶中，加13倍量20%甲醇，分别于49，59，69，79，89℃水浴回流1.5h，提取4次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，抽滤转入10ml容量瓶内，加甲醇定容至刻度摇匀备用。测定含量，记录数据见表7。结果：选择89℃提取效果最佳。表7提取温度（℃）提取率（%）490.0362590.0406690.0511790.0568890.06364.4响应面法对老鼠簕中2-苯并噁唑啉酮提取条件的优化 据单因素试验结果进行显著性检验，对含量结果有显著影响的分别为提取次数(A)、提取时间(B)、料液比(C)及醇浓度(D)。根据响应面Box-Benhnken设计实验原理，采用四因素三水平的分析方法实验优选最佳提取工艺，以2-苯并噁唑啉酮的百分含量（%）为考察指标，在高效液相色谱条件乙腈：水30:70，检测波长270nm下进行分析。响应面实验方差分析变异来源平方和自由度均方F值P值模型7.669E-004145.478E-0059.84<0.0001significantA-A4.206E-00714.206E-0070.0760.7874B-B1.244E-00411.244E-00422.350.0003C-C1.088E-00411.088E-00419.550.0006D-D9.146E-00519.146E-00516.440.0012AB1.426E-00511.426E-0052.560.1318AC5.781E-00615.781E-0061.040.3253AD1.575E-00511.575E-0052.830.1146BC1.271E-00611.271E-0060.230.6401BD5.987E-00615.987E-0061.080.3172CD4.806E-00514.806E-0058.640.0108A21.534E-00411.534E-00427.570.0001B22.229E-00412.229E-00440.06<0.0001C29.214E-00519.214E-00516.560.0011D24.760E-00514.760E-0058.550.0111残差7.790E-005145.564E-006失拟项3.921E-005103.921E-0060.410.8875notsignificant净误差3.869E-00549.674E-006总变异8.448E-00428由方差分析已知，模型的F值为9.84。“Prob>F”的值小于0.0500,说明二次方程拟合显著。失拟项为0.8875，说明失拟项绝对误差不显著。在此情况下，B，C，D，CD，A2，B2，C2，D2均有显著影响，其中CD具有交互作用。4.5薄层鉴别4.5.1芹菜素薄层对照品溶液的制备精密称定芹菜素对照品加甲醇溶解制得浓度为0.02mg/ml的芹菜素对照品溶液。供试品溶液的制备精密称定老鼠簕药材全株粉末1g，加乙酸乙酯20ml超声提取20mi