生物基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

基因工程的基本操作程序第一课时第2节人教版选择性必修31.能阐明目的基因筛选与获取的方法。2.能阐述基因表达载体构建的流程。

2025/4/20

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？转基因抗虫棉非转基因抗虫棉培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？培育转基因抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。前提核心关键保证

目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。目的基因“杀虫基因”:Bt抗虫蛋白基因目的基因的筛选和获取

根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。也可以是一些具有调控作用的因子。知识回顾

请从DNA水平上给基因下一个定义，要求既能反映基因与DNA的关系，又能体现基因的作用。基因通常是有遗传效应的DNA片段但一段DNA片段不一定是基因--ATGCATGCATCGATGCTAGCGATCGCTAAGCACAG-----TACGTACGTAGCTACGATCGCTAGCGATTCGTGTC---基因1基因2非基因片段非编码区非编码区启动子编码区原核生物基因终止子补充知识：基因结构：非编码区

组成：编码区上游与编码区下游

功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达

启动子：RNA聚合酶结合位点转录起始的信号

终止子：终止RNA的合成编码蛋白质的合成加工转录mRNA前体成熟mRNA真核细胞的基因非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345启动子终止子补充知识：基因结构：

目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因是什么？用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息对Bt基因的表达产物--对Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因获取目的基因的常用方法有哪些?从基因文库中寻找聚合酶链式反应（PCR）扩增化学合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知初始目的基因的来源1.从生物中直接获取2.人工合成注意：要保持基因的完整性1.筛选合适的目的基因2025/4/202.利用PCR获取和扩增目的基因（1）PCR：是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。全称：聚合酶链式反应。原理：DNA半保留复制。操作环境：体外（PCR扩增仪/PCR仪）。目的：对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。优点：可以在短时间内大量扩增目的基因。PCR扩增仪（2）DNA体内复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸2025/4/20一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(RNA单链)（3）DNA体外复制（PCR）的条件参与的组分在DNA复制中的作用90℃以上高温DNA母链*4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物缓冲液（含Mg2+)提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链（变性）催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸2025/4/20(DNA单链)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶（4）PCR过程：2025/4/20扩增的过程①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链；②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。如此重复循环多次，由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。TaqDNA聚合酶的应用

高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。PCR和细胞内复制的不同点？缓冲液需要为PCR反应提供的物质？DNA模板，四种脱氧核苷酸，分别与两条模板链相结合的两种引物，Taq酶。关于PCR的几点说明：2025/4/203.获取目的基因的其他方法（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①基因组文库：含有一种生物的全部基因。提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接基因表达载体导入受体菌中储存基因组文库②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA反（逆）

转录酶单链互补DNADNA聚合酶双链DNA片段与载体连接基因表达载体导入受体菌中储存cDNA文库真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子2025/4/20基因组DNA文库与cDNA文库的比较

文库类型cDNA文库

基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）

基因多少

物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以2025/4/202025/4/20（2）利用化学方法人工合成①需要仪器：DNA合成仪。②适用目的基因类型：要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知；③不需要模板。1.操作目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的构成启动子目的基因限制酶切割位点复制原点标记基因终止子（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）目的基因启动子终止子标记基因基因表达载体的构建（1）启动子思考:表达载体为什么一定要有启动子？

生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。操纵基因结构基因

启动子RNA聚合酶（1）启动子①本质:一段有特殊序列结构的DNA片段②位置:位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点。③特殊类型：诱导型启动子。④诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达

。（2）终止子①本质:一段有特殊序列结构的DNA片段。②位置:位于基因的下游。③功能：使转录在所需要的地方停下来。（3）标记基因①作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的重组DNA分子细胞筛选出来。②常见类型:抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能补充：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）质粒启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点限制酶目的基因限制酶切割位点限制酶获取目的基因连接酶重组DNA分子

载体（质粒）含有目的基因的DNA片段同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割带有黏性末端（或平末端）的切口带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）基因表达载体构建模式图3.基因表达载体的构建过程2025/4/20

将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？

有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进