细菌内毒素检查法讲稿

细菌内毒素检查法讲稿2热原热原就是指临床上引起哺乳动物发热反应得物质细胞分裂素(IL-1,IL-2,IL-6,IL-8)内源性热原产生细胞分裂素得物质内毒素热原外源性热原

非内毒素热原(病毒、细菌、真菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素)3细菌内毒素细菌内毒素就是革兰氏阴性细菌细胞壁得组分之一化学结构含有3个不同得区域

O-特异侧链

核心多糖

类脂A

4细菌内毒素致热性内毒素作用于人体细胞,使之释放内原性热原,再刺激下丘脑体温调节中枢,引起发热反应耐热性分子极性多糖链有亲水性,脂肪链具有疏水性在水中呈不均匀分布酸碱性与强酸强碱水解反应鲎反应性5C因子活化得C因子内毒素活化得B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白(凝胶)凝固蛋白原二价阳离子β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化得G因子G因子细菌内毒素检查法反应机理能与鲎得血液提取物可发生发生多级酶促反应,形成凝胶6细菌内毒素检查法反应机理在药品生产质量管理规范(GMP)条件下进行药品生产得质量控制,一般可以接受得观点就是,不存在内毒素就意味着不存在热原通过检测内毒素控制药品中得热原7Boc-leu-Gly-Arg-PNA(鲎三肽)活化得C因子C因子内毒素活化得B因子B因子显色法凝胶法,浊度法凝固酶凝固酶原凝固蛋白(凝胶)凝固蛋白原β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反应）G因子8细菌内毒素检查法定义:本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生得细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素得限量就是否符合规定得一种方法。二、细菌内毒素检查法介绍

9细菌内毒素检查包括:限量实验凝胶法半定量实验可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。

浊度法动态浊度法光度测定法终点浊度法显色基质法动态显色法终点显色法

二、细菌内毒素检查法介绍

10

细菌内毒素检查凝胶法11细菌内毒素检查----------凝胶法

1、综述部分实验原理实验准备限值(L)得确定确定最大有效稀释倍数(MVD)2、实验部分鲎试剂灵敏度复核干扰实验:预实验正式干扰实验检查法:限量试验半定量试验12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流13C因子活化得C因子内毒素活化得B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白原凝固蛋白(凝胶)二价阳离子1、凝胶法实验原理1437±1℃下保温反应60

2分钟当样品中细菌内毒素得浓度达到或超过鲎试剂得灵敏度时,凝集为坚实凝胶,为阳性,记为“+”。当样品中细菌内毒素得浓度未达到鲎试剂得灵敏度时,不能凝集为坚实凝胶,为阴性,记为“—”。1、凝胶法实验原理152、凝胶法实验得准备实验所需物品细菌内毒素标准物质细菌内毒素检查用水凝胶法鲎试剂漩涡混合器适宜得恒温器37±1℃电热干燥箱250℃实验器械等16细菌内毒素标准物质国家标准品以内毒素国际标准品为基准标定效价

150600-20070710000EU/支工作标准品以内毒素国家标准品为基准标定效价

150601-200862120EU/支2、凝胶法实验得准备17细菌内毒素检查用水用于复溶内毒素标准品、稀释内毒素及样品、溶解鲎试剂等凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0、015EU/ml得灭菌注射用水。2、凝胶法实验得准备18凝胶法鲎试剂8个鲎试剂厂家灵敏度0、5~0、03EU/ml规格0、5ml、0、1ml等

2、凝胶法实验得准备19漩涡混合器

2、凝胶法实验得准备20适宜得恒温器恒温水浴恒温培养箱干热恒温器

2、凝胶法实验得准备21试验器械得要求移液管(或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头)、凝集管(10×75mm)、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器、75%酒精棉、剪刀、砂轮。试验所用得器皿需经处理,以去除可能存在得外源性内毒素。常用得方法就是在250℃干烤至少60分钟,也可采用其她确证不干扰细菌内毒素检查得适宜方法。2、凝胶法实验得准备22试验器械得要求若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套得吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰得器械。试验操作过程应防止微生物得污染。2、凝胶法实验得准备23供试品溶液得制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液得pH值在6、0～8、0得范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力得供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)得pH值,可使用酸、碱溶液或适宜得缓冲液调节pH值。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。2、凝胶法实验得准备243、限值(L)得确定《中国药典》标准、国家药品标准药品、生物制品得细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定:L=K/M253、限值(L)得确定L=K/ML为供试品得细菌内毒素限值,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按规定得给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受得内毒素剂量,以EU/kg/h表示。其中注射剂,K＝5EU/kg/h;放射性药品注射剂,K＝2、5EU/kg/h;鞘内用药品,K=0、2EU/kg/h。M为人用每公斤体重每小时最大剂量,以ml/kg/h、mg/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅《临床用药须知》或药品使用说明书。中国人均体重按60kg计算,注射时间小于1小时得按1小时计。263、限值(L)得确定计算举例:注射用阿莫西林钠

根据国家药典委员会编纂得《临床用药须知》:

“肌肉注射或稀释后静脉滴注,一次0、5~1g,一日3~4次;小儿按体重每日50~100mg/kg,分3~4次静脉滴注。”M成人=1000mg/h÷60kg=16、67mg/(kg·h)

M儿童=100mg/(kg·h)÷3=33、3mg/(kg·h)L=K/M=5EU/(kg·h)÷33、3mg/(kg·h)=0、150EU/mg273、限值(L)得确定限值计算时做必要调整得几种情况从严原则联合用药特殊情况等284、确定最大有效稀释倍数(MVD)最大有效稀释倍数就是指供试品溶液被允许稀释得最大倍数,在不超过此稀释倍数得浓度下进行内毒素限值得检测。

MVD=cL/λ294、确定最大有效稀释倍数(MVD)MVD=cL/λL:供试品得细菌内毒素限值c:供试品溶液得浓度λ:在凝胶法中鲎试剂得标示灵敏度(EU/ml)304、确定最大有效稀释倍数(MVD)计算举例:a、当L以EU/ml表示时,则C等于1、0ml/ml

适用于供试品为溶液状态,并且规定限值为应小于xxEU/ml。例:替硝唑注射液,计算限值为0、5EU/ml,使用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂进行检验,则

MVD=1、0ml/ml

0、5EU/ml÷0、125EU/ml=4倍314、确定最大有效稀释倍数(MVD)计算举例:b、当L以EU/mg或EU/U表示时,浓度c得单位需为mg/ml或U/ml。适用于供试品为固体状态,如粉针;或液体但就是规定限值为应小于xxEU/mg或EU/U。

324、确定最大有效稀释倍数(MVD)例:注射用阿莫西林钠

计算限值为0、15EU/mg,使用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂进行检验。需先称取一定重量得注射用阿莫西林钠,在已除去外源性内毒素得容器中,用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度得溶液。如称取100mg注射用阿莫西林钠,用5ml内毒素检查用水溶解,即成为浓度为20mg/ml得阿莫西林钠溶液。

MVD=20mg/ml

0、15EU/mg÷0、125EU/ml=24倍334、确定最大有效稀释倍数(MVD)如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MVD取1,计算供试品得最小有效稀释浓度c=λ/L;

适用于供试品为固体得情况。计算得到得最小有效稀释浓度即为MVD下得该供试品得浓度。例:注射用阿莫西林钠

计算限值为0、15EU/mg,使用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂进行检验。最小有效稀释浓度c=

0、125EU/ml÷0、15EU/mg=0、833mg/ml

34细菌内毒素检查----------凝胶法

2、实验部分鲎试剂灵敏度复核干扰实验:预实验正式干扰实验检查法:限量试验半定量试验35鲎试剂灵敏度复核试验目得:不仅就是考察鲎试剂灵敏度就是否准确,也就是考查检验人员操作方法就是否正确及实验条件就是否符合规定。要求每个实验室在使用一批新得鲎试剂前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。36鲎试剂灵敏度复核试验实验操作:取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支,加入规定量得细菌内毒素检查用水溶解其内容物,用封口膜将瓶口封严,置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释,制备成4个浓度得细菌内毒素标准溶液,即2、0λ、1、0λ、0、5λ、0、25λ(λ为所复核得鲎试剂得标示灵敏度),每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。37鲎试剂灵敏度复核试验内毒素浓度2λλ0、5λ0、25λ

阴性对照

鲎试剂

平行管

38鲎试剂灵敏度复核试验放入37℃±1℃得恒温器中,保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成得凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。39坚实凝胶阳性“+”40未形成凝胶凝胶不坚实阴性“—”41鲎试剂灵敏度复核试验结果判断:

若最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0、25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。结果计算:

反应终点浓度得几何平均值,即为鲎试剂灵敏度得测定值(λc)。

λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度得对数值(lg)。反应终点浓度就是指系列递减得内毒素浓度中最后一个呈阳性结果得浓度。42鲎试剂灵敏度复核试验内毒素浓度2λλ0、5λ0、25λ阴性对照终点

鲎试剂

平行管

+—

λ

λ0、5λ0、5λλc=lg-1((lgλ+lgλ+lg0、5λ+lg0、5λ)/4)=0、707λ+++++++++———————43鲎试剂灵敏度复核试验当λc在0、5λ～2λ(包括0、5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查。以标示灵敏度λ为该批鲎试剂得灵敏度。44凝胶法干扰试验目得:就是确定供试品在多大得稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂得反应不存在干扰作用,为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。未进行过内毒素检查法验证得样品当供试品得配方和工艺有变化,或供试品阳性对照结果呈阴性时验证供试品就是否存在干扰作用。

45凝胶法干扰试验试验操作:在干扰试验中,使用得供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)得溶液。解释:即与所使用得鲎试剂反应,不出现阳性得供试品溶液。46凝胶法干扰试验试验操作:预试验正式干扰实验47凝胶法干扰试验预试验目得:初步确定供试品得最大不干扰浓度(当限值以EU/mg或EU/u活性单位表示)或最小不干扰稀释倍数(当限值以EU/ml表示),为正式干扰实验提供依据。优点:减少摸索过程、节省成本48凝胶法干扰试验预试验将供试品溶液进行一系列倍数得稀释。使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照(即含2、0λ浓度标准内毒素得该浓度得供试品稀释液)。另做2支阴性对照,和2支阳性对照。49凝胶法干扰试验预试验——结果判断当阴性对照为阴性,阳性对照为阳性时,实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性,供试品阳性对照2管为阳性时,认为供试品在该浓度下不干扰实验,此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。50凝胶法干扰试验预试验举例供试品限值硫酸庆大霉素,100ml/瓶,20000U/ml;药典要求,硫酸庆大霉素限值L=0、5EU/1000U51凝胶法干扰试验预试验举例系列稀释倍数得确定稀释倍数一般为MVD0、5~MVD0、03,不大于MVD0、03。MVD0、5=cL/λ=由此可计算出使用不同λ时所对应得MVD:=20（倍）0.5EU/ml20000U/ml×0.5EU/1000U灵敏度λ(EU/ml)0、50、250、1250、060、03对应得MVD(倍)20408016032052凝胶法干扰试验预试验试验结果稀释倍数

原液20倍40倍80倍160倍320倍样品溶液PPCNCPC--++如上结果可初步确定该批硫酸庆大霉素得最小不干扰稀释倍数为80倍,可在此浓度下进行正式干扰实验。-----+++++++------------53凝胶法干扰试验正式干扰试验目得:检验在某一浓度下得供试品对于鲎试剂与内毒素得反应有无干扰作用。54凝胶法干扰试验正式干扰试验目得:检验在某一浓度下得供试品对于鲎试剂与内毒素得反应有无干扰作用。通过比较鲎试剂与在水溶液中得内毒素和供试品溶液中得内毒素反应得差异程度,来确定供试品在该浓度下就是否对内毒素检查有干扰。55凝胶法干扰试验正式干扰试验操作:内毒素检查用水同一支内毒素标准品供试品溶液同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。

含2、0λ、λ、0、5λ、0、25λ得内毒素标准溶液含2、0λ、λ、0、5λ、0、25λ得内毒素得供试品溶液

56凝胶法干扰试验

正式干扰试验结果判断:当供试品阴性对照和阴性对照都为阴性用检查用水稀释得标准内毒素系列得结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时试验方为有效57凝胶法干扰试验

正式干扰试验分别计算用检查用水制成得内毒素标准溶液得反应终点浓度得几何平均值(ES)和用供试品溶液或稀释液制成得内毒素溶液得反应终点浓度得几何平均值(Et)。

Es=lg-1(ΣXs/4)Et=lg-1(ΣXt/4)当Es在0、5λ～2λ(包括0、5λ和2λ)及Et在0、5Es~2Es(包括0、5Es和2Es)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。58凝胶法干扰试验

正式干扰试验试验举例硫酸庆大霉素根据干扰初筛试验得结果,供试品在80倍稀释时无干扰(对应鲎试剂灵敏度为0、125EU/ml)选择将供试品稀释80倍进行干扰验证试验。选用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂59凝胶法干扰试验

正式干扰试验试验举例制备含内毒素得供试品80倍稀释溶液

方法1:标准品+1ml检查用水溶解用硫酸庆大霉素80倍稀释溶液将内毒素稀释至2、0λ、λ、0、5λ、0、25λ得浓度60凝胶法干扰试验

正式干扰试验试验举例制备含内毒素得供试品80倍稀释溶液

方法2:标准品+1ml检查用水溶解用检查用水将内毒素稀释至4、0λ、2、0λ、λ、0、5λ0、5ml4、0λ内毒素溶液

1ml含2、0λ内毒素得80倍稀释溶液……0、5ml40倍稀释溶液61内毒素浓度0、250、1250、060、03EU/ml内毒素/检查用水阴性对照内毒素/供试品80倍稀释溶液供试品80倍稀释溶液阴性对照62内毒素浓度0、250、1250、060、03终点内毒素/检查用水阴性对照内毒素/供试品80倍稀释溶液供试品80倍稀释溶液阴性对照

Es=lg-1(ΣXs/4)=0、125Et=lg-1(ΣXt/4)=0、1770、1250、1250、250、250、1250、1250、1250、12563凝胶法干扰试验

导致干扰得因素:pH值抗凝因子螯合剂葡聚糖……、64凝胶法干扰试验

排除干扰得方法:稀释中和过滤加热……65凝胶法干扰试验

为确保所选择得处理方法能有效得排除干扰且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理得供试品溶液进行干扰试验。即,先在供试品溶液中添加2λ浓度得标准内毒素,然后用所选择得方法处理溶液,而后再进行稀释、检测。66凝胶法干扰试验

由于干扰实验检验得就是在供试品存在得情况下内毒素与鲎试剂得反应就是否正常,与所使用鲎试剂得灵敏度无关,因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度得鲎试剂。建议使用较低灵敏度(如0、5或0、25EU/ml)得鲎试剂,可尽量避免供试品所含得内毒素对干扰实验造成得阳性影响。67凝胶法干扰试验

当进行新药得内毒素检查试验前,或无内毒素检查项得品种建立内毒素检查法时,须进行干扰试验。须:三个批号以上得供试品,两个以上鲎试剂厂家得试剂。当鲎试剂、供试品得配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果得变化时,须重新进行干扰试验。如:内毒素检查时,供试品阳性对照为阴性时68凝胶法----检查法

凝胶限量试验检验供试品中得内毒素含量就是否小于限值得定性方法。每批供试品必须做

2支供试品管

2支供试品阳性对照

同时

每次实验须做2支阳性对照和2支阴性对照。

69凝胶法----检查法

凝胶限量试验例:替硝唑注射液,计算限值为0、5EU/ml,使用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂进行检验,计算

MVD=1、0ml/ml

0、5EU/ml÷0、125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照供试品溶液:4倍替硝唑稀释液供试品阳性对照为:含0、25EU/ml标准内毒素得4倍替硝唑稀释液阳性对照为:浓度为0、25EU/ml得标准内毒素溶液70凝胶法----检查法

凝胶限量试验例:替硝唑注射液,计算限值为0、5EU/ml,使用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂进行检验,计算

MVD=1、0ml/ml

0、5EU/ml÷0、125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照++--++试验有效71凝胶法----检查法

凝胶限量试验例:替硝唑注射液,计算限值为0、5EU/ml,使用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂进行检验,计算

MVD=1、0ml/ml

0、5EU/ml÷0、125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照++--++--

此批替硝唑注射液得内毒素含量小于0、5EU/ml,符合规定。72凝胶法----检查法

凝胶限量试验例:替硝唑注射液,计算限值为0、5EU/ml,使用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂进行检验,计算

MVD=1、0ml/ml

0、5EU/ml÷0、125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照

此批替硝唑注射液得内毒素含量不小于0、5EU/ml,

不符合规定。++++++--73凝胶法----检查法

凝胶限量试验例:替硝唑注射液,计算限值为0、5EU/ml,使用灵敏度为0、125EU/ml得鲎试剂进行检验,计算

MVD=1、0ml/ml

0、5EU/ml÷0、125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照

须复试。---+++++74凝胶法----检查法

凝胶限量试验复试时,供试品溶液需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,判供试品符合规定;否则判供试品不符合规定。供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照--++++75凝胶法----检查法

凝胶半定量试验半定量试验就是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量得方法。系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素得含量。76凝胶法----检查法

凝胶半定量试验原理:通过供试品系列稀释液与鲎试剂反应,其反应终点浓度得稀释倍数与鲎试剂灵敏度得乘积即为供试品得内毒素含量。操作:用检查用水将供试品溶液从已确定得不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释,制备成2、4、8倍得稀释液,但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂得MVD。77编号内毒素浓度/配制内毒素得溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素得浓度平行管数A

无/供试品溶液检查用水1248—2222B2λ/供试品溶液12λC2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0、5λ0、25λ2222D无/检查用水———2A:没有超过MVD并且通过干扰试验得供试品系列稀释液。B:供试品阳性对照。(为确证不存在干扰作用)C:标准内毒素系列。(为确证本次试验得操作和环境都符合要求。)D:阴性对照。

78凝胶法----检查法

凝胶半定量试验结果判断:当阴性对照溶液D得平行管均为阴供试品阳性对照溶液B得平行管均为阳性系列溶液C得反应终点浓度得几何平均值在0、5λ～2λ之间试验有效79凝胶法----检查法

凝胶半定量试验结果计算:内毒素浓度2、0λλ0、5λ0、25λ终点标准内毒素系列溶液C稀释倍数1248供试品系列溶液APPC溶液BNC溶液D80凝胶法----检查法

凝胶半定量试验结果计算:内毒素浓度2、0λλ0、5λ0、25λ终点标准内毒素系列溶液C0、5λλ稀释倍数1248供试品系列溶液APPC溶液BNC溶液Dλc=lg-1(∑X/2)=0、707λ,在0、5λ～2λ之间仍以标示灵敏度λ为该批鲎试剂得灵敏度。81凝胶法----检查法

凝胶半定量试验结果计算:内毒素浓度2、0λλ0、5λ0、25λ终点标准内毒素系列溶液C0、5λλ稀释倍数1248供试品系列溶液A4

λ2

λPPC溶液BNC溶液DCE=lg-1(∑X/2)=lg-1((lg4λ+lg2λ)

/2)=2