DB12-T838-2018-辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法-天津市

ICS65.020.20DB12B04天津市地方标准DB12/T838—2018辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法MethodofidentifyingseedpurityofpepperbyusingSSR-basedmarker天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T838—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所。本标准主要起草人：兰青阔、吕敬刚、赵新、王成、兰璞、焦荻、高素燕、陈锐、关海涛、张耀中、焦贺敏。IDB12/T838—2018辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法12范围本标准规定了辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。本标准适用于辣椒单交种的纯度鉴定。规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。种子纯度seedpurity种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.44SSR分布于辣椒整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行辣椒种子纯度鉴定。51DB12/T838—20185.1仪器设备PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W）；万分之一电子天平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；pH计等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；TaqDNA聚合酶（含Mg的10×PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸2+（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；GoldView染料；定性PCR试剂盒；DNA提取试剂盒；实验用水为重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。5.3溶液配制相关溶液配制方法见附录A。6方法步骤6.1取样检测样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定，从中随机取100粒以上种子，取其父母本材料各10份。在玻璃培养皿底部垫上一层厚度约3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地撒上检测样品，再于表面覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h35℃光照培养，8h28℃暗培养，待种子长出子叶后备用。取单株幼苗子叶，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管放入400µL混合样品，将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温30min后取下，向离心管中加入400µL24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10000g离心10min。将上清液200µL转入另一支1.5mL离心管，加入400µL-20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，弃上清液，加入500µL乙醇——乙酸铵溶液，6000g离心5min收集沉淀。加入100µLTE（pH8.0）溶液溶解DNA。将DNA适当稀释或浓缩，使其OD260值在0.1～0.8的区间内，测定并记录其在260nm和280nm的吸光度。以1个OD260值相当于50mg/LDNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。DNA溶液的OD260/OD280值应在1.7～2.0之间，或质量能复合检测要求。2DB12/T838—2018用22对核心引物进行PCR反应，扩增双亲及送检样品各10份DNA，筛选带型清晰，双亲间差异大，互补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。6.4PCR扩增6.4.1反应体系总体积10μL，包括5μL超纯水、1μL含Mg的10×PCR缓冲液、0.8μLdNTPs（2.5mmol/L）、2+0.6μLSSR引物（10μmol/L）、1μLTaqDNA聚合酶（2.5U/μL）、1μLDNA（30～50ng/μL），混匀。6.4.2反应程序94℃预变性4min；94℃变性45s，按附录B推荐的引物退火温度退火45s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸10min；-20℃保存备用。6.5变性聚丙烯酰氨凝胶电泳按照附录C规定的方法，进行4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。7纯度计算以筛选出来的SSR分子标记为引物扩增送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下：3DB12/T838—2018AA附录A（规范性附录）溶液配制A.1DNA提取液含有200mmol/LTris-HCl（pH8.0），250mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA，0.5%SDS，经高压蒸汽灭菌后使用。A.2引物稀释按照引物合成单的说明先配制100μmol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5mmol/L的使用液。A.36×变性上样缓冲液去离子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，溴酚蓝0.125g，二甲苯青0.125g。A.410×电泳缓冲液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液37mL，定容至1000mL。1mL剥离硅烷，49mL三氯甲烷。0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。现用现配。4DB12/T838—2018A.10A.11A.12固定液200mL冰醋酸，定容至2000mL。染色液4g硝酸银，定容至2000mL。显影液2000mL蒸馏水中加入40g氢氧化钠和10mL甲醛。5DB12/T838—2018BB附录B（规范性附录）22对核心引物22对核心引物见表B.1。表B.122对核心引物表序号引物引物序列（5’—3’）退火温度℃扩增片段大小范围（bp）F:AGCCATGGCAGAATTGGAAGR:TTCAGCAGGTTCTGGTTCTGGTF:CGCATCTACATCAAGAATCAACCAR:GATGTAGAACAAGGAAGCAGGGF:GAUGAATTTTGGAGCCACACACR:AGGTGAAATGGGCAGTGGTAGAF:CAAAACCAAATAGGTCCCCCR:CGCGCAATAATTCAATATCGF:TGCGAGTACCGAGTTCTTTCTAGR:GGCAGTCCTGGGACAACTCGF:ATGTCGCTCGCAATTTCACTR:CGTAGGGAGGAGCGATAGAGF:CGGCCAAATTATTTTTCCCAGTR:TTCCCATAGTTGAAGAUCCTGCF:TACGGTTCCTCATCCCAGAAGAR:AGGATGACCAATGTTTTGCCTCF:CCCTTCCCTTTTCTCCCTTCTTR:CAGAAACAGCCATTGATGATGF:GCGGCCTTTTGATTCATACAATR:CGTTTTACTGCCCTATCTGCTTGF:GCACGAGUCAACAAAAGAGAATR:CGCTGAUCGAGACAGAGAGAGF:TCCCATTTCGCAAGAAAGAAAAR:TCCGATACAGCTGCAGTAGAAAAF,TCAGCGATTAAGAATGCGATTGR:CCAAATTGCCCTCTCTCTTCCTF:TGTAATTAATTGAGGTGCGCUAR:TCTCTGGTTGACAATTAGGCCCF:TCCAAACTACAAGCCTGCCTAACCR:TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGCF:CCACAAAGGGTTTAAGCAGCR:AAGGCAGGAGCAGAGTTCAAF:AATGCGGAGGAAGAAGAGGAAGR:TAGTCCTTATCACCGACACGGC12LJ-1LJ-25454526058605453545653545253656054555654545897~121150~15485~1173LJ-34LJ-4274~34281~1015LJ-56LJ-6106~118136~145138~151142~157155~165118~121119~135116~12284~1027LJ-7142~160126~14373~94F:ACGAGGTCCACTTCCCCATTATR:TTAGAGAAGGAATAACCGGCAGCF:CGCGATTCGATTGCTAAATCTCR:CTAATTTCCCAGTTGCGTCTGCF:TTCGGCTATTTGAACAGAAGCAR:TGATCCCTTCTTGTTTGATTTTTGF:TTTTGGGGTTCAATAAAGCTGTGR:TTCAACAAGATCATCAATTCACCA106~124237~255140~168150~150289~3186DB12/T838—2018CC附录C（规范性附录）制胶过程C.1凝胶制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂1%亲和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将其组装好，用水平仪调平。取4.5%丙烯酰胺胶80mL，加入TEMED80μL和10%过硫酸铵400μL，迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1h以上。C.2预电泳待胶凝固后，拔出梳子，将电泳槽组装好，80W恒功率下预电泳15min～20min。C.3变性在20μLPCR产物中加入4μL6×变性上样缓冲液，混匀后