DNA重组实验中常用的关键技术资料

DNA重组实验中惯用技术

一、质粒DNA提取及鉴定

(一)质粒DNA提取及鉴定

1.收获细菌

(1)将2ml含相应抗生素LB液体培养基加入到通气良好15ml试管中，接入一单菌落，于37。。激烈振荡培养

过夜。

(2)将1.5ml培养物倒入1.5物离心管中,用台式离心机于4℃以1g离心5min,将剩余培养物贮存于

(3)吸尽培养液，使细菌沉淀尽量干燥。

2.碱裂解法小量抽提质粒

(1)将细菌沉淀［上述环节(3)所得］重悬于100-预冷溶液I(50mmo!/L葡萄糖,25mmol/lTris-HC1pH8.0,

10mmol/LEDTA)中，激烈振荡。

(2)加200川新配制溶液II(O.2mol/1NaOH,1%SDS),缓和很荡，水浴5min。

(3)加150回预冷溶液HI(50mol/LKAC60ml,冰乙酸11.5mL水28.5ml),缓和振荡，冰浴5min。

(4)4℃以1g离心5min,将上清转移到另一离心萱中。

(5)可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2,(4)。

(6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA,振荡混合，于室温放置2min。

(7)4℃以1g离心5min。

(8)小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上,再将附于管壁液滴除尽。

(9)用75%乙醇于4c洗涤DNA,同上离心去上清真空抽干。

(10)加50W1XTE(含20卜ig/ml无DNA酶胰RNA酶)，振荡，贮存于・20℃。

(二)质粒DNA大量制备

(1)同上1.(1)

(2)将1ml含菌液倒入含相应抗生素Lb100ml中，37c振荡培养至A590=1.0(5〜6h)。

(3)加氯霉素(170pg/ml)扩增，37℃温箱中培养过夜。

(4)收集菌液于离心管中,冰浴lOmiiio3000rpm,离心10min»去上清。

(5)加溶液15ml悬浮菌体,将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min.

(6)加溶液II10ml轻轻混匀,笃温下5min。

(7)加溶液轻轻混匀，冰浴30min。150(X)rpin,4℃离心20min。

(8)取上清液于高速离心管中，加2倍体积无水乙醇，混匀，入-20C3〜5h。

(9)15000rpm4℃离心20min。

(10)弃上清,将离心管倒放入真空泵中抽干(10〜15min清

(11)用5mHxTE溶解,加入RNaseA15〜20nL42c水浴4h于过夜。

(12)加入5ml饱和酚，混匀，4000〜5000rpm离心5min,取上清液入5ml离心管内。

(13)分别加入22ml饱和酚,2.5ml氯仿,混匀后同样离心收集上清。

(14)加等体积氯仿/异戊醇(24：1)混匀，同样离心收集上清。

(15)加入1/10体积3mol/lNaAc及2倍体积无水乙醉于-2O℃3〜5h。

(16)lOOOOrpm4℃离心20min。

(17)弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

(18)离心弃上清，真空抽干，加入适量IxTE溶解质粒DNA。

(三)质粒DNA鉴定

1.酶切反映

(1)在0.5mlEppendorf管中加重蒸水63,1OxBuffer1川，DNA2pil,酶1川混匀,37℃水浴lh以上。

(2)取反映物点样，观测能切效果。

(3)酶切完全后,70℃5min终结反映。

2.琼脂糖电泳

(1)配制所需浓度琼脂糖凝胶。

(2)在待测DNA样品中加1/5体积澳酚蓝批示剂，混匀后点样。

(3)打开电源开关，5V/cm电泳。

(4)在UV灯下观测电泳成果。

二、DNA重组

(一)DNA能切与连接

(1)酶切反映

同质粒DNA鉴定，只但是是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增长。

(2)加2倍体积预冷无水乙醇和1/10体积3moi/!NaAc混匀，・20C2h以上。

(3)l5000rpm离心15min,弃上清。

(4)加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。

(5)加入适量IxTE溶解。如此可得线性化逊DNA。

(6)测定DNA含量。

(7)加入线性载生DNA和含量3〜4倍于载体待插入DNA片段.连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20gL

在12〜14℃反映12〜16h。

(8)连接反映液可置-20C保存，供转化用。

(9)关于待插入DNA片段获得参见附注。

(-)大肠杆菌感受态制备及重组DNA转化

1.感受态制备

(1)接种单菌落于2mlLB培养液中，37℃过夜。

(2)取0.25ml过夜菌入25mlLB培养液中,37℃振摇4〜6h至A590=0.4〜0.6。

(3)倒入50ml管内，水浴l()min,以2500〜300()rpm离心5min,弃上清。

(4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min,同上离心弃上清。

(5)缓慢加入75mmol/L预冷CaC121.0ml轻轻混匀后分装在1.5mlEppcndorf管中，每管200M，冰浴1〜2h。

2.重组DNA转化

(I)将3只Eppcndorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：

转化项目受体菌DNA总体积

DNA对照组010pl200pl

受体菌对照组200gl0200m

转化组190pl10pl200pl

(2)冰浴30min至lh。中间摇动3次，以防受体菌沉底。

(3)42℃90so

(4)37℃水浴5min。

(5)加入无相应抗生素Lb200|il,混匀后，37℃水浴30〜60min。

(6)分别取3组反映物各50皿在含相应抗生素固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置F37C温

箱中培养过夜。

(三)转化子DNA迅速鉴定一迅速细胞破碎法

(1)挑取转化平板上单菌接种于含相应抗生素2mlLB中，37二振荡培养至A590值为0.6〜0.8。

(2)取1ml菌液至1.5mlEppcndorf管中,9000rpm离心9n】in,去尽上清。

(3)加入70川CrackingGel缓冲液［Imol/LTris-HCl(pH6.8)10ml,20%SDS10ml,250mmol/LEDTA1.6ml,蔗糖

27.2g,1.2%浪酚蓝1.67ml,加双蒸水至200ml］,混匀后，37℃水浴30min以上。

（4）15000rpm离心15min。

（5）吸取上清点样电泳，观测。

（四）转化子DNA酶切鉴定

1.转化子DNA迅速少量抽提

（1）同本节二.（三）.1.

（2）菌液移至5mlEppendorf管中,9000rpm,离心9min,去上清。

（3）加溶液11加比溶液0200川，溶液1山50川混匀，冰浴lOmin。

（4）15000rpm离心15min。

（5）吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15〜30min。

（6）15000rpm离心15min,弃上清,加入75%乙醇洗涤2次。

（7）离心弃上清，真空抽干，加入适量IxTE溶解DNA。

（8）取少量DNA电泳，观测浓度。

2.转化子DNA小量酶切鉴定同质粒DNA小量酶切鉴定，见本节一（三）。

（五）重组子DNA进一步鉴定

可用Soulhern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节四。

［附］电泳洗脱法回收酶切DNA片段

（1）用适当酶切割DNA并电泳。

（2）于紫外灯下从凝胶上切下所要DNA带，装入含IxTBE缓冲液透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无

漏孔。

（3）将透析袋（纵长）与两极间边线垂直放于电泳槽内电泳，4〜5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。

（4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml离心管内，lOOOOrpm离心5min。

（5）吸出上清放入离心管内，加入等体积饱和酚和等体积氯仿，振荡混匀，lOOOOrpm离心5min,吸出上清放

入新离心管内。

（6）加入1/10体积3moi/LAaAc,2倍体积预冷无水乙醇，于-20℃放置4〜5h°

（7）于4℃,lOOOOrpm离心15min,弃上清。

（8）用75%酒精洗涤2次，每次均于4C,lOOOOrpm离心5min,弃上清。

（9）真空抽干，并用适量IxTE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

三、地高辛配基随机标记DNA探针法

(-)概述

基为诊断是以核酸分子杂交技术为基本，在核酸水平检测人类遗传性疾病基因缺陷和某些传染病病原体办法。

其基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。开展这项工作核心是要得到高敏捷度、高特异性探针。以

往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记办法发展不久，己有取代同位素标记法趋势。

地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功一种非同位素标记办法。其原理是：用化学办法把类固醉类半抗原

地高辛分子连接在dUTP上(Dig-dUTP)o用随机引物及DNA多聚能，以探针DNA为模板，合成互补DNA,化

学修饰过dUTP同步掺入到标记DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗与标记探针DNA中Dig-dUTP

结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色化合物。

1.标记本试剂盒采用随机引物标记办法，可标记少至10ng,多至3pgDNA。能在新合成DNA链每20〜25

个核甘酸，掺入一种Dig-dUTP,反映时间约为lh°

2.杂交按原则杂交办法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过杂交液可冻存于-20℃,重复使用。

3.免疫学检测封阻后，检测反映第一步，抗体结合物与标记DNA结合，浮现杂交半抗原-标记DNA,显色

反映起始是在碱性pH条件下加入无色显色剂X-磷酸盐和NBT,在几分钟内便开始浮现蓝色，显色反映过程持续

3d。典型例子是在24h后终结显色反映。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。

4.应用地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒，能检测O.ipg同源DNA,能检测1pg哺乳动物DAN中单

拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能迅速得到实验成果(从DNA标记和朵交至见到检测成果24h内能

完毕)，并且消除了放射性不安全问题。这试剂敏捷度与特异性使它合用于所有杂交技术(涉及DNA-印迹转移，菌

落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交)以代替同位索标记和放射自显影术。

(二)试剂盒成分

1.无标记对照DNA1此管内有20|ilpBR328DNA100pg/ml,pBR328分别用BamHI,BglItHinfI消化,它们

混合比例为2：3：3,共有16个Pbr328片段,这些片段人小分别为:4907,2176,1766,1230,1033,653,517,

453,298,234,234,220和154x2bp。

2.无标记对照DNA2此管内有20可pBR328DNA200gg/ml,已用EcoRI线性化。

3.DNA稀释缓冲液有两管，每管成分为：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(lmn】ol/L),pH8.0(2()℃)］内含酷鱼

精DNA(50gg/ml)o

4.标记对照DNA此管内有50囚线性化pBR328DNA,按标记办法已标记有地高辛配基dUTP,含20pg模板

DNA,每痘升含5Hg合成标记DNA。

5.六聚核昔酸混合物

6.标记用混合底物此管内有50m10倍浓度dNTP标记用混合底物，含dATP(Immol/L)

dCTP(lmmol/L),dGTP(lmmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20*C)o

7.DNA聚合酶I大片段(标记级)此管内有251dDNA聚合酶I大片段(Klenow),2U/gl0

8.(Dig)AP结合物此管内有200卜11多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶75()U/ml,

9.NBT有两管，每管1.25ml,是溶于70%(V/V)二甲基甲酰胺硝基蓝四哩盐溶液(75mg/ml)。

10.X-磷酸盐有两管，每管0.9ml,是溶于二甲基甲酰胺5-溟4氯-3啊跺磷酸盐甲苯胺溶液(50mg/ml)。

11.封阻试剂有两瓶，每瓶有50g粉剂。

(三)需配制溶液

EDTA(0.2mol/L),pH8.0(20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(K)mmol/L);ED

TA(lm【nol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐；10%(V/V)SDS；20xSSC：3mol/l、aCl;0.3mol/L柠

檬酸三钠；pH7.0Tris-HCI(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris

-HC1(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgC12(50mmol/L)pH9.5(20℃)o

(四)操作办法

1.标记DNA探针每次原则反映可标记10ng至3卜ig线性DNA,也可标记更大量DNA,但所有成分和体积

要相应增长。

(1)DNA探针热变性，煮沸l()：nin,迅速冷却于冰/乙静中5min以上，待用。

(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上，加下列及试剂：

新鲜变性DNAl-3pg

六聚核甘酸混合物2位(管5)

dNTP标记用混合底物2M(管6)

加无菌重蒸水至19gl

DNA聚合晦I大片段(Klenow)Ipl(管7)

(3)在37℃保温至少60min,匕到20h。

(4)煮沸5min,终结反映。

(5)15000rpm离心30s,置于冰上待用。

2.预杂交按100cm2膜用20-40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处在流动状态。

预杂交液构成：5xSSC

().5%(W/V)封阻试剂(管11)

0.1%(W/V)N-十二烷酰肌敏酸讷

0.G2%(W/V)SDS

膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65c预杂交过夜。

3.杂交按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面溶液重新分派。

杂交液构成：50%甲酰胺(V/V)

5%(W/V)封阻试剂

5xSSC

0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%(W/V)SDS

新变性标记DNA(150ng/ml)

杂交液取代预杂交液，替代间膜不能干，成功地替代应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42C杂交过夜

(16~20h)。

4.洗膜按100cm2膜用250ml洗膜液计算。

(I)在室温下用2XSSC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗，5min,2次。

(2)在65℃条件下用0.1xSSC/0.1%SDS溶液漂洗，lOmin,2次。

(3)在室温卜用2XSSC溶液漂洗1次。

5.免疫测定

(I)配制溶液

缓冲液1：Tris-HCI(1OOmmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)

缓冲液2：0.5%(W/V)封阻试剂(管II),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会迅速溶解，因而应预早lh前配制此溶液,

将试剂溶于50〜70℃,此溶液保持混浊)。

缓冲液3：Tris-HCI(1OOmmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20,C).

缓冲液4：Tris-HCI(1Ommol/I);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

显色溶液:新鲜配制，在10ml缓冲液3中,加45WNBT溶液(管9)和35出X-磷酸盐缓冲液(管10)。

2.显色过程

A.膜在缓冲液1中短暂洗涤＜hnin)o

B.在100ml缓冲2中保温30mino

C.再用缓冲液1短暂洗涤。

D.用缓冲液1稀释抗体结合物（管8）至150U/L（1:5000）;稀释后抗体结合物在4℃只能稳定⑵。

E.膜在20ml稀释抗体结合物溶液中保温30min。

F.用100ml缓冲液1洗膜，以除去未结合抗体结合物,15min,2次。

G膜在缓冲液3中平衡2mino

H.在黑暗条件下，膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入适当盒子内，几分钟内开始浮现颜色，普通显色反

映在1天后所有完毕。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。

I.当规定点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终结反映。

J.摄相。

阐明：上述各反映均在室温下进行，除了显色反映外，均需振荡或搅拌。

（五）排除实验中问题办法

1.DNA不能有效地被标记时考虑

（I）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNAo

（2）标记反映保温时间延长（增至20h）。

（3）DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。

2.不能达到预期敏捷度时考虑

（I）DNA标记率。

（2）增长标记DNA浓度或增长杂交时间。

（3）显色反映时间可延长至3d。

3.若显色时背景过深，可采用

（I）在杂交溶液中减少标记DNA最。

（2）增长杂交溶液体枳，使膜随意漂浮在溶液中。

（3）某些类型尼龙膜也许产生深色背景，因而可采用其他类型尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。

（4）在杂交和检测过程中增长封阻试剂浓度。

四、核酸分子杂交

核酸分子固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上，然后与溶液中标记探针进行杂交。当前使用最

多固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点简介直接点样技术，转移技术及其他惯用杂交技术。

（-）斑点杂交直接点样法

斑点杂交或叫打点杂交（dot-blothybridization）,其重要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸

样品，操作简便，敏捷度而。一种点样品只含0.25〜IpgDNA也能检测到。但不懂得杂交片段大小（碱基对数）。

1.DNA打点法（DNaDotBlot）

（1）膜解决：戴上干净手套，取出硝酸纤维膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。

（2）DNA变性：将DNA溶液于IxTE（pH8.0）缓冲液中或蒸储水中，取一定量DNA样品加于小塑料管中，

在100C沸水中煮lOmin,迅速入冰水中。

（3）点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1〜5m变性DNA,将滴管放在硝酸纤维膜上，使DNA慢慢吸

在滤膜上，点样完后凉干。

（4）固定：将凉干滤膜夹在滤纸中，于80c干烤2〜3h,然后进行杂交。

2.RNA打点法（RNaDotBlot）

（1）膜解决：同DNA打点法。

（2）RNA变性:将提取RNA与50pd20xSSC/甲醛（30孤20xSSC加20m甲醛）混合，65c水浴15min.

（3）点样：同DNA打点法。

（4）固定：同DNA打点法。

（二）DNA吸印转移法（SouthernBlot）

DNA通过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后单链DNA从凝胶中按本来位

置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此办法比较精确地保持了特异DNA序列在电

泳图谱中位置，并且能测定分子量。

试剂:变性液：0.5mol/LNaOH,l.5moi/LNaCl

中和液：ImoVlTris-HCL1.5moKLNaClpH8.0

20xSSC:0.3mol/L柠檬酸钠，3moi/INaCl

1.电泳取DNA约加限制性内切酶进行酶切，电泳鉴定酶切完全后，取酶消化后DNA点样于0.8%〜1.2%

凝胶上，以0.8〜IV/cm电压电泳过夜，在浪酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后凝胶翻转，紫外灯照射

10〜20min后拍照。

2.变性与中和将电泳后凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸饲水洗胶Imin,将凝胶放入中和液中25c振

荡60min<>

3.转移取托盘•只，放入IOKSSC溶液约500T000N,托盘上搭•块比凝胶稍宽长方形坂璃，取•K方形

Watemanpaper（滤纸）搭在桥上，两边浸入lOxSSC溶液中，仔细去掉玻璃与滤纸之间气泡（用玻棒在滤纸上滚动）。

将凝胶放在滤纸上，去掉凝胶与滤纸之间气泡。将硝酸纤维膜放入2XSSC溶液中浸湿后放在凝胶上（如NC膜浸湿

不均匀，则考虑更换NC膜，操作时手切勿触及NC膜），去掉凝胶与NC膜之间气泡。将一张浓纸（长和宽均比

NC膜小1mm）放在NC膜上，仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小，重叠放在滤纸上，再后一重物约500〜

lOOOgo转膜24h,中间更换吸水纸。

回

图23-7Southem转膜示意图

4.固定用2XSSC溶液洗膜5min去掉残存凝胶，让膜自然凉干。将凝胶放入EB液中30min,取出在UV

灯下观测与否有DNA残存。80c烤膜2h,然后将膜封入塑料袋进行杂交。

（三）RNA吸印转移法（Northernblol）

在RNA凝胶电泳之前，先用乙二醛等变性剂解决RNA,再在适当条件下电泳使充分变性RNA直接吸印到硝

酸纤维摸上。固定后除去变性剂，然后进行杂交。

试剂：

乙二醛：4mol/L（约为30%）,通过阴阳离子互换树脂纯化，使pH为5.5〜6.0

磷酸缓冲液:80mmol/LpH6.5〜7.0

磷酸缓冲液：IOmmol/LpH6.5〜7.0

Tris-HCl:20mmol/LpH7.8

二甲基亚飒：分析纯

20xSSC：0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/lNaCl

1.RNA变性吸取80mmol/L磷酸缓冲液，RNA样品（最多lOOpg）,2可，4mol/l乙二醇，4川二甲基

亚碉。混匀后，50℃水浴lh,然后放入冰中。

2.电泳变性结束后，加入具有50%甘油I0mmol/L磷酸缓冲液2川和少量嗅酚蓝，混匀后点样于1.0%凝胶

上，以4〜5V/cm电压电泳。凝胶电泳液为10mmol/L磷酸缓冲液，pH6.5〜7.0。

3.转移变性解决后RNA可以转移并结合到硝酸纤维膜上，转移过程和转移变性与DNA相似。

4.固定用20xSSC转移RNA。膜夹在两层干净滤纸中凉干后，80℃烤膜2h

5.乙二醛附加物消除RNA膜固定后，放入20mmol/lTris-HQ中，100C解决5〜10min,去除乙二醛，然后

进行杂交。

（四）硝酸纤维膜固相杂交

核酸样品通过直接点样或转移到硝酸纤维膜上，固定后，可以进行杂交反映。在杂交溶液中，硝酸纤维膜上变

性核酸样品和变性后探针在一定条件下形成双链杂交核酸分子。然后进行酶标显色。

试剂及操作办法见本节三。

五、真核细胞基因组DNA制备

从不同组织细胞或血细胞中提取DNA是进行基因诊断先决条件。制备DNA原则是既要将蛋H质、脂类、糖类

等物质分离干净，又要保持DNA分子完整。蛋白酶K应用使这两个原则得到了保证。在提取DNA反映体系中，

SDS是离子型表面活性剂，重要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞膜；（2）解聚细胞中核蛋白；（3）与蛋白质

结合，使蛋白质变性而沉淀卜来。蛋白的K可将蛋白降解成小多肽和氨基酸，使DNA分子尽量完整地分离出来。

详细办法如下：

（一）白细胞DNA制备

（1）采集外周静脉血10ml,加1.7mlACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2

灭菌30min）抗凝。

（2）将血液放入已灭菌50ml塑料离心管内，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、lOmmol/1Tris-HCl（pH7.5）＞5mmol/L

MgC12，l%Triton-X1（X）],轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解.

（3）冰浴lOmin,离心，3000rpm,10mino弃上清，STMT重复解决1〜3次。

（4）弃上清，白色沉淀物加10mlSTE[0.1mol/LNaCl、lOmmol/lTris-HCl（pH8.0）.Immol/LEDTA（pH8.0）J,先

少量,充分混匀,然后加10mg/ml蛋白酶KlOOg20%SDS30gl,摇匀，置37c水浴15〜20h。

（5）用等体积饱和酚抽提,3000rpm离心5体n。

（6）用大口钝缘吸管小心吸取上层水相，加饱和酚和氯仿-异戊醉（24：1）抽提，300（）rpm离心5min。

（7）小心吸取上层水相，用等体积氯仿-异戊醇（24：1）,抽提，3000rpm离心5min。

（8）小心吸取上层水相，加入W0体积3moi/lNaAc,2.5体积预冷无水乙醉混匀，-20℃过夜。

（9）将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管内，加1ml75%乙醇4℃静置lh,离心，lOOOOrpm10min.

（10）弃上清，用蜡膜将管口封好,针刺数个小孔，真空抽提（10〜

（ID加200MlxTE溶解,置4c保存。

（12）对所提DNA用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。

（13）取2〜4gDNA样品，经琼脂糖凝胶（Agarose）电泳，检查所提DNA质显及降解状况。

（二）组织DNA制备

（1）将2（）0mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4mlIxRSB缓冲液（lOmmol/LTris，pH7.4;10mmol/l

NaCl;25mmol/LEDTA,pH7.4）放入ICml带盖塑料管中。

(2)加SDS至浓度为1%(可加0.4mll0%SDS),混匀。由于DNA从核中释放出来，样品变得粘稠。

(3)力口10mg/ml蛋白酶k44HL终浓度为lOOpl/mL37c保温1〜3d,直到组织完全解体。中间可振动样品管

几次。加0.4ml5mol/LNaCL

(4)用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醉及等体积氯仿-异戊醇(24：1)各抽提一次，3000ipm

离心5门in,用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。

(5)加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状大片段DNA,并移入一新管，吸干

DNA中无水乙醵。

(6)DNA溶于4mlO.lxSSC中，4c过夜可作进一步纯化。

(7)加20WRNaseA(10mg/ml),37℃保温5h0加0.4ml5moi/LNaCL

(8)同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀离心，弃上清。

(9)75%乙醇洗涤2次，离心，弃上清，真空抽干。适量IxTE溶解，保存在4℃。

六、转移基因

最惯用将克隆重组DNA片段导入哺乳动物细胞办法是用磷酸钙介导转染。转染DNA也许是通过吞饮作用进入

细胞质，然后进行细胞核。

(I)配制下列溶液

①2XHEPES-缓冲盐溶液(HBS)

②2moi/LCaC12

@O.lxTE(pH8.O))IJ0.22nm滤器过滤除菌，分装贮存于4℃。

④DNA：将DNA(约20啥106细胞)溶于O.lxTE(pH8.0),使用浓度为4()卜ig/ml。为使转化效率达到最高，

质粒DNA应用CsCN臭化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。如果所用DNA量较少，应加入载体DNA将DNA浓度调

至40%/ml。实验室制备真核载体DNA转染效率普通要比商品化牛胸腺DNA、鞋鱼精DNA高。载体DNA用前应

通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。

(2)转染前24h用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期细胞，以1-2x105细胞/cm2密度重新种入60mm组

织培养皿中。在37C、5%〜7%CO2及一定湿度培养箱中培养20〜24h。

(3)每转染一种60mm培养孤中单层细胞，须依如下办法制备磷酸钙-DNA共沉淀物：取环节一所制备

DNA^Ogg/'ml,溶于0.1xTE(pH8.0)]220|J,2xHBs250iU,放入一次性使用灭菌5ml塑料管中，缓慢加入311112mo1/1氯

化钙(温和混合30s左右)。于室温育20-3()min,其间将形成细小沉淀。温育结束时，用吸管将混合液吹打•次，

使沉淀物悬浮。

普通采用另一方案是将氯化钙和DNA稀释混合液加入2XHBS溶液中，逐滴加入并小心混合250川按环节一制

备并溶于氯化钙（250mmol/L）DNA。按照前述办法温育之。

如果需要转染更为大量细胞，上述两种反映混合液体枳均可翻一番或翻两番。如果体枳翻两番，则须使用更大

塑料管，普通在25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上,可将0.5ml磷酸钙-DNA共沉淀物加入5ml培养液中，

而在90mm细胞培养皿上,普通将1ml沉淀物加入10ml培养液中。

已经刊登方案中，混合各组分方式与速率大不相似。其中有某些以为除了温和振摇之外，其他办法均无济于事,

并建议用电动移液装置吹出空气来混合溶液。其他某些方案则规劝在加入DNA溶液时持续而缓慢地混匀，然后再

温和振荡。其目是为了避免急速形成粗沉淀物，以致减少转化效率。事实上，除了混合速度之外，尚有其他若干因

素涉及DNA浓度和大小（让高分子量DNA从细针头中通过，可将之剪切变小）、缓冲液精准pH（有些工作者配制

了几批pH范畴从6.95至7.1不等HBS缓冲液，逐批实验沉淀物质量及转染效率）。如果必要使转染效率达到最高，

就要花时间针对特定系统优化上述几种因素。一旦得到一批灵验试剂，只需依照前面办法进行配制和贮存，即可在

长期内获得可重复成果。

（4）将磷酸钙-DNA悬液转移至细胞单层上培养液中［在60mm培养皿中，可将0.5ml整液加入5ml培养液中］,

轻轻左右晃动一下培养皿使培养液得以混合，此时可见培养液成黄橙色浑浊状。另一办法是吸出培养液，直接把沉

淀物加到细胞上，将细胞置于室温温育15min,然后再将培养液加回到培养皿中，此时细胞上有许多细小颗粒。采

用以上两种办法，都要在37C、5%〜7%CO2及一定湿度培养箱中将转染细胞培养长达24h［时间长短取决于后续解

决环节不同，见环节（5）Jo

（5）然后，转染细胞可依如下任一种办法解决：

①如果不进行其他解决（如用氯「奎、甘油或丁酸钠等试剂解决，见后），可在细胞培养16〜24h后，吸出培养

液和沉淀物，用PBS将单层细胞再洗一次。然后按下述③d操作。

②在许多状况下，同步用氯哇解决细胞，可提高DNA摄入率。氯喳也许是通过抑制溶酶体水解酶类对DNA

降解而起作用。氯唾浓度及其解决时间不能超越细胞对其毒性作