食品毒理学 课件 第七章一般毒性及其评价方法

第七章

化学毒物的一般毒性作用掌握一般毒性作用概念、试验目的1熟悉一般毒性试验方法要点2熟悉蓄积毒作用的概念3了解蓄积毒作用研究方法4目的要求一般毒性作用（基础毒性作用）外来化合物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对实验动物产生综合毒效应的能力称为一般毒性作用（generaltoxicity)或基础毒性作用（basictoxicity)。

一般毒性作用分为急性毒性、蓄积毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。

防治急慢性中毒；安全性评价和危险度评定;制订卫生标准；管理毒理学的决策一般毒性作用的类型一般毒性测试

了解毒性大小特征

了解污染物理化特征

了解在体内蓄积和耐受性了解对机体毒作用靶点和指标

确定阈值和阈下剂量

急性毒性试验急性致死试验急性非致死试验

蓄积毒性试验亚急性毒性试验亚慢性毒性试验

慢性毒性试验（≤3个月）（3~6个月）（6个月至终身）第一节一般毒性评价的实验设计一、试验动物的选择二、染毒方法的选择1.物种、品系的选择2.动物繁殖方式的选择3.实验动物微生物控制的选择4.个体选择5.实验动物的随机分组6.实验动物的饲养管理1.经消化道染毒途径2.经呼吸道染毒途径3.经皮肤染毒途径4.经注射途径染毒一、实验动物的选择标准化的实验动物是指遗传背景明确、饲养环境和体内微生物得到控制、符合一切标准的动物。动物种数很多，脊椎动物有43000种，其中哺乳动物也有4500种。毒理学实验选择哺乳动物。一般要求选用两种以上不同物种的动物，一种是啮齿类，一种是非啮齿类。选用解剖生理特点符合实验目的要求的实验动物做实验，是保证试验成功的关键。0102选用原则根据实验目的选择那些在代谢功能上与人接近的、对化学物感受性与人比较一致的、经济易得的实验动物。031、物种品系的选择啮齿目是哺乳动物中的一目，其特征为上颌和下颌各两颗会持续生长的门牙，啮齿目动物必须通过啃咬来不断磨短这两对门牙。哺乳动物中百分之四十的物种都属于啮齿目，而且在除了南极洲的其他所有大陆上都可以找到其大量的踪迹。下颌关节突与颅骨的关节窝联结比较松弛，既可前后移动，又能左右错动，既能压碎食物，又能碾磨植物纤维。听泡较发达，盲肠较粗大。雌性具双角子宫，雄性的睾丸在非繁殖期间萎缩并隐于腹腔内。个体数目远远超过其他全部类群数目的总和。毒性学研究中敏感实验动物的选择研究目的首选动物方案不宜使用的动物备注气体、蒸汽对黏膜的刺激作用猫毒物对皮肤的局部作用豚鼠或兔它们的皮肤对刺激物的反应近似于人致呕吐作用的实验狗、猫食草动物如兔、豚鼠过敏性反应豚鼠>家兔>狗>小鼠>猫高血压病理模型狗、兔、大鼠外界环境因素引起机体体温影响兔、猫致癌作用大鼠、小鼠大鼠、小鼠慢性中毒损害实质性脏器小鼠迟发性神经毒母鸡2、动物繁殖方式的选择在选择实验动物时，应选纯度高、敏感性强的健康品系。（1）近亲繁殖：纯品系。优点：对外源性化学物敏感性较为一致，实验结果个体差异小、重现性好；缺点：体弱易病，对外界环境适应能力差。（2）异系杂交：选择2个不同的近交系动物有目的进行交配繁殖，他们的个体之间在遗传上是一致的，但又非近亲，适于做毒理实验。（3）随机繁殖：在同一种群内，无血缘关系的个体之间随机交配所产生的后代。如果5年以上没有从外部引入其他任何品系新的血缘，仅在原种群内保持繁殖的动物称为“封闭群动物”。优点：大量生产，适应性和抗病力强。3、实验动物微生物控制的选择

I级普通动物，要求动物没有传染给人的疾病。Ⅱ级清洁动物，即除I级标准外，应在一般实验动物室内繁殖饲养，种系清楚，不杂乱，没有该动物所特有的疾病。Ⅲ级无特定病原体动物，即除Ⅱ级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产，按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，只有不致病的细菌群，没有致病病原体。Ⅳ级无菌动物，即在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，其体内外不带有任何微生物和寄生虫（包括大部分病毒）。无菌动物饲养室无尘无菌室4、个体选择：在实验中同种动物的个体之间也可因年龄、性别、生理及健康状况等因素，对同一种化学物的敏感性不尽一致，从而影响实验结果。通常同一实验，各剂量组动物平均体重相差不超过5%，组内个体体重差异应小于10%。

5、实验动物的随机分组：随机化原则，即用实验设计所规定的方法，使每只动物都有同等机会被分配到各实验组中去。

6、实验动物的饲养管理：喂养条件和喂养环境可以影响外源化学物的毒性效应，为此应给实验动物提供营养合理的饲料以及清洁、充足的饮水，动物室应保持清洁以及适宜的温度和湿度，实验动物有稳定的生物时间节律。我国实行实验动物的质量监督和质量合格证制度。二、染毒方法的选择外源性化学物的毒理学实验，必须模拟人体主要接触方式将受试物通过某种途径给予实验动物，这种接触方式称为染毒。毒物经胃肠道吸收时，化学物经门静脉系统首先到达肝脏进行生物转化。毒物经呼吸道吸收时，可首先分布于全身并进入中枢神经系统发生麻醉作用。经皮毒性往往较经口毒性小。静脉注射>呼吸道>腹腔注射>肌内注射>经口>经皮染毒途径的选择原则要与人接触受试物的实际途径相同。1、经消化道染毒途径

在急性毒性试验中，经口染毒是最常用和最主要的染毒途径，常用于研究非挥发性液体和固体化学物经消化道吸收的毒性和毒作用机制。a.灌胃法：将受试的化学物配成一定浓度的液体剂型，借助灌胃器、或导管人为直接定量经实验动物的食道灌入胃内。b.喂食法：将受试的化学物质溶于某种溶剂中，拌入饲料或水中，让受试动物自由摄取。按动物每日的采食量或饮水量计算动物实际摄入化学物的剂量。c.胶囊吞服法：将所需剂量的受试物装入药用的胶囊内，强制放到动物的后舌咽部迫使其咽下。灌胃器2、经呼吸道染毒途径

经呼吸道染毒是评价空气污染物优先考虑的染毒途径。（1）吸入染毒法：吸入染毒是将实验动物置于含有外源性化学物质的空气环境中，使其自然吸入的方式。分为静式吸入染毒和动式吸入染毒。（2）气管注入法：人工将受试的外源性化学物质直接注入动物气管的方式。分为插入法、气管穿刺法、暴露气管穿刺法3、经皮肤染毒途径

（1）涂皮染毒法：实验前需先脱毛（2）浸尾法：小鼠浸尾染毒实验可定性判断受试物是否具有经皮吸收作用。浸尾染毒时，将小鼠放在特制的玻璃管内，使其尾巴通过玻璃管底塞子中央的小孔插入装有受试物液体的试管里，尾巴浸入部分至少为尾长的2/3，浸泡时间一般为2~6h。4、经注射途径染毒

进行化学毒物的毒作用机制研究、比较毒性研究、了解化学毒物代谢与毒物动力学参数或对急救药物进行筛选研究时，常采用注射途径染毒。分为腹腔注射、静脉注射、肌内注射、皮下注射等。第二节急性毒性试验急性毒性和急性毒性试验的目的急性毒性试验急性毒性分级123一、急性毒性急性毒性(acutetoxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次大剂量接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的快速而剧烈的中毒反应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。最主要观察指标是LD50。二、急性毒性试验的目的①测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度。②并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。③探求化学毒物急性毒性的剂量—反应关系与中毒特征。④为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考依据。⑤研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。⑥为毒理学机制研究提供线索

。

急性毒性试验常用的毒性参数：LD50/LC50（半数死亡的毒物浓度）Zac

（LD50/Limac）（急性毒作用带）LD84/LD16(或LC84／LC16)剂量—反应曲线斜率三、急性毒性试验方法的要点(一)试验动物[原则]：①急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。②动物易于获得③品系纯化④价格较低和易于饲养等条件。

1．试验动物的种属和品系最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。⒉试验动物的年龄和体重：急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的10％。

3.试验动物的性别：

雌雄各半；如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值；特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验。

4.动物数量与随机分组：实验方法不同采用的动物的数量不同分组原则——随机化、均衡性的原则5.禁食：经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食大鼠、小鼠——隔夜进食；染毒后禁食4h大动物——每日上午喂食前染毒染毒后继续禁食2-4h，但在禁食时要保障饮水。6.试验动物的预检：选择健康动物1-2周的检疫期（二）受试物及处理

常用剂型为水溶液、混悬液、油溶液

水溶性受试物，胃肠道外染毒需用生理盐水，保持与体内渗透压一致。水不溶性受试物，溶于或悬浮于适当的有机溶剂中。受试物一般应临用前现配适宜容积染毒①经口：20ml/kg(空腹动物)；②经皮：2ml/kg；③静脉：1ml/kg(5min以上)；④肌肉注射：0.5ml/kg(一个部位)；⑤眼睛：0.01ml/每眼；⑥直肠：0.5ml/kg；⑦阴道：大鼠0.2ml，兔lml；⑧吸入：2mg/L；⑨鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。

（三）试验动物的饲养环境恒定的温度：22±3℃湿度：30~70%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格（四）染毒途径的选择:

染毒途径（exposureroutes）的选择需考虑：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。染毒途径影响受试物急性毒性

静脉注射>吸入>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射>经口>皮内注射>经皮。同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常符合上述规律。经口(胃肠道)接触:

灌胃:小鼠0.2

1.0ml/只或0.1

0.5ml/10g

大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只家兔不超过10ml/2kg

狗不超过50ml/10kg

与饲料或饮用水混合：

吞咽胶囊:经呼吸道接触:

静式吸入、动式吸入经皮肤接触:注射途径接触:

（五）试验周期与毒效应观察1.中毒症状毒性表现与器官或系统的关系

2.体重在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化原因：若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物．应在观察期14天内称量其体重的变化．以便了解受试物引起毒效应的持续时间。3.病理检查及其他指标:对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查．必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目．如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。4.死亡和死亡时间重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深入研究化学物的毒作用机制提供参考。

(六)经典急性毒性试验的局限性1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。三、急性毒性评价外源化学物急性毒性分级（WHO）毒性分级大鼠一次经口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm)兔经皮LD50(/mg/kg)对人可能致死的估计量g/kg总量(g/60kg)剧毒<1<10<5<0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250实际无毒5000~10000~2180~>15>1000三、急性毒性评价我国食品毒理急性毒性分级法(1994)急性毒性分级大鼠经口LD50(mg/kg)大致相当于70kg人的致死量6级(极毒)<1稍尝,<7滴5级(剧毒)1~507滴~1茶匙4级(中等毒)51~5001茶匙~35克3级(低毒)501~500035~350克2级(实际无毒)5001~15000350~1050克1级(无毒)>15000>1050克12基本概念蓄积毒性试验方法及其评价ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.第三节蓄积毒性一、基本概念

化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。蓄积作用物质蓄积（materialaccumulation）反复多次接触化学毒，可以用分析方法测出体内物质的原型或其代谢产物。功能蓄积（functionalaccumulation）长期接触某些化学毒物后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用。

物质蓄积功能蓄积反复多次接触化学毒，可以用分析方法测出体内物质的原型或其代谢产物长期接触某些化学毒物后，机体不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用蓄积作用蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。二、蓄积毒性试验方法及其评价蓄积作用的研究方法（一）蓄积系数法以生物效应为指标，用经验系数（K）评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应进行比较。简便，但不能区分化学毒物的蓄积性是物质蓄积还是功能蓄积。(一)蓄积系数法

蓄积系数(accumulationcoefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即：

K＝ED50(n)/ED50(1)K＝LD50(n)/LD50(1)蓄积作用的研究方法反复染毒时实验动物对化学毒物发生过敏现象，可能出现K<1。大、小鼠；经口灌胃、腹腔注射；先求LD50，然后选取相同条件的40只（或更多）实验动物，随机分为两组，一为染毒试验组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。动物染毒途径方法二、蓄积毒性试验方法及其评价1．固定剂量法：

在1/20-1/5LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量，定时和相同途径对试验组进行染毒，观察记录动物死亡数。

试验组累积发生一半动物死亡即终止试验。计算累积总接触剂量[LD50(n)]，根据公式计算K值，然后进行评价。

接触剂量累积达5个LD50，可终止试验，K>5。固定剂量法试验期为25-100天。2．剂量递增法：

在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD50，即K＞5。使用本方法时要注意染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物的染毒剂量。3．剂量固定的20天蓄积法：

它通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20LD50、l/10LD50、1/5LD50和1/2LD50四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。

评定标准4各剂量组均无死亡，即为蓄积性不明显1235仅1/2LD50剂量组有死亡，则为弱蓄积性1/20LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量-反应关系时，则为中等蓄积性如1/20LD50剂量组有死亡，且有剂量-反应关系，则为强蓄积性生物半衰期是进入机体的外源性化学物质在体内消除一半时所需要的时间。生物半衰期的测定方法是在受试动物接触外来化学物之后，测定动物血浆中该化学物质在不同时间的浓度。生物半衰期较短的物质达到蓄积极限所需要的时间短，机体一旦停止接触该物质，也易于很快从机体消除。123（二）生物半衰期法第四节亚慢性和慢性毒性试验一亚慢性毒性作用：

亚慢性毒性的概念亚慢性毒性试验的目的亚慢性毒性试验的设计

二慢性毒性作用：

慢性毒性的概念慢性毒性试验的目的慢性毒性试验设计亚慢性毒性慢性毒性亚慢性毒性是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化合物所引起的毒性效应一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的慢性毒性是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应亚慢性毒性实验目的观察受试物以不同剂量水平较长期喂养，对动物的毒性作用性质和靶器官，并初步确定最大无作用剂量和最小有作用剂量。分析受试物的剂量-效应关系。为慢性毒性试验的剂量设计和观察指标提供依据。为评价受试物能否应用提供依据。慢性毒性试验目的

1.确定造成损害作用的最低剂量（LOAEL)和未观察到损害作用的最大剂量（NOLAE)，对最终评价受试物能否应用提供依据。2.进一步研究慢性毒作用的特点、毒作用的靶器官及毒理机制，为外推到人的安全系数选择提供参考。ADI值是根据对小动物（大鼠、小鼠等）近乎一生的长期毒性试验中所求得的最大无作用量（MNL）,取其1/100-1/500作为ADI值。

二、亚慢性和慢性毒性试验设计（一）实验动物选择

亚慢性毒性试验

年龄：大鼠80~100g

狗8~12月小鼠10~15g数量：小动物≥20

大动物≥6性别：雌雄各半

慢性毒性试验年龄：大鼠50~70g

狗<8月小鼠初断乳数量：小动物≥40

大动物≥8性别：雌雄各半（二）实验动物染毒期限：工业毒理学——3－6个月食品毒理学——6个月－1年环境毒理学——6个月－1年致癌试验——接近或等于动物的预期寿命（二）实验动物染毒期限

经消化道经呼吸道经皮