《免疫细胞分离技术》课件

免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术是现代免疫学研究和临床应用的基础工具。通过各种先进的分离技术，科研人员能够从复杂的混合组织中获得高纯度的目标免疫细胞，用于后续的功能研究、药物筛选和免疫治疗。本课程将系统介绍各类免疫细胞的分离原理和方法，包括密度梯度离心、免疫亲和、流式细胞术和磁珠分选等核心技术，以及不同免疫细胞类型的特异性分离策略和注意事项。课程概述1课程内容本课程共十章，涵盖免疫细胞基础知识、分离原理、各类细胞的特异性分离方法、纯度检测和功能验证。从理论到实践，全面介绍现代免疫细胞分离技术的应用。2授课方式理论与实践相结合，通过多媒体教学、实验室演示和案例分析，帮助学生掌握关键技术和方法。每章结束后有练习题和讨论环节，促进知识内化。3适用对象免疫学、细胞生物学、生物医学工程等专业高年级本科生、研究生，以及从事免疫学研究、细胞治疗和临床诊断的专业技术人员。学习目标掌握基础知识理解各类免疫细胞的生物学特性、表面标志物和功能特点，为分离技术的选择和应用奠定理论基础。熟悉技术原理掌握密度梯度离心、免疫亲和分离、流式细胞分选和磁珠分选等主要分离技术的工作原理、适用范围和操作流程。实践操作技能能够独立完成外周血单个核细胞分离、T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞的分离，并进行纯度检测和功能验证。培养科研能力能够针对不同研究目的，设计合理的细胞分离策略，解决分离过程中的常见问题，并将分离技术应用于实际科研和临床工作。第一章：免疫细胞简介免疫细胞是机体免疫系统的核心执行单位，负责识别和清除外来病原体、异常自身细胞和有害物质。它们广泛分布于血液、淋巴组织和各种组织器官中，共同构成了人体的免疫防御网络。免疫细胞根据发育来源可分为骨髓源性和胸腺源性；根据功能可分为先天免疫细胞和适应性免疫细胞。不同类型的免疫细胞在形态、表面标志物、功能机制和分布位置等方面存在显著差异。研究免疫细胞的分离技术，首先需要了解各类免疫细胞的基本生物学特性，以便选择合适的分离方法和策略。本章将概述主要免疫细胞类型的特征及其在免疫应答中的作用。免疫细胞的类型淋巴细胞包括T细胞、B细胞和NK细胞，主要参与特异性免疫应答和免疫记忆形成，是适应性免疫的核心细胞。吞噬细胞包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，负责吞噬和消化病原体及死亡细胞，同时分泌细胞因子调节免疫反应。抗原提呈细胞主要包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，能够摄取、加工和提呈抗原，激活T细胞，连接先天免疫和适应性免疫。淋巴细胞定义与特征淋巴细胞是最主要的免疫细胞类型，约占白细胞总数的20-40%。它们体积小，核大细胞质少，在血液和淋巴组织中广泛分布，是适应性免疫的主要执行细胞。分类根据发育来源和功能，淋巴细胞可分为T细胞、B细胞和NK细胞三大类。它们各自表达不同的表面分子，执行不同的免疫功能，共同参与机体的免疫防御。生物学特性淋巴细胞具有识别特异性抗原、产生免疫记忆和自我调节等特点。它们在静息状态下体积小，活化后可增大并快速增殖，分化为效应细胞和记忆细胞。T细胞发育和分化T细胞源于骨髓造血干细胞，在胸腺中发育成熟，经过阳性选择和阴性选择，确保只有能够识别自身MHC但不与自身抗原过度反应的T细胞才能存活。分类与功能T细胞主要分为CD4+辅助T细胞（Th）和CD8+细胞毒性T细胞（CTL）。Th细胞可进一步分化为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞（Treg）等亚型，参与调节免疫应答；CTL直接杀伤被病原体感染的细胞。表面标志物所有成熟T细胞表面均表达CD3和T细胞受体（TCR）复合物。此外，不同亚群还表达特异性标志物，如CD4、CD8、CD25、CD45RA、CD45RO等，用于区分不同功能的T细胞亚群。B细胞1发育过程B细胞在骨髓中发育，经过多个阶段（前B细胞、前B细胞、未成熟B细胞）后成为成熟的初始B细胞，迁移至脾脏和淋巴结等外周淋巴组织。发育过程中，B细胞重排免疫球蛋白基因，形成独特的B细胞受体（BCR）。2功能特点B细胞是体液免疫的主要执行细胞，能够识别可溶性抗原，在T细胞帮助下活化、增殖并分化为浆细胞，分泌抗原特异性抗体。部分活化B细胞可分化为长寿命的记忆B细胞，负责免疫记忆的形成。3表面标志物成熟B细胞表面表达多种特征性分子，包括B细胞受体（膜表面免疫球蛋白）、CD19、CD20、CD21、CD22和CD40等。这些分子既是B细胞鉴定的标志，也是B细胞分离的靶点。NK细胞定义与起源自然杀伤（NK）细胞是一类大颗粒淋巴细胞，属于先天免疫系统，起源于骨髓造血干细胞，但其发育途径与T细胞和B细胞不同。NK细胞约占外周血淋巴细胞的5-15%。1识别机制NK细胞通过表面的激活受体和抑制受体平衡调节识别靶细胞。当细胞表面MHC-I分子缺失或表达异常（如肿瘤细胞、病毒感染细胞），抑制信号减弱，激活信号占优，NK细胞被激活。2功能作用NK细胞可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，无需事先致敏；能分泌多种细胞因子如IFN-γ、TNF-α等，调节免疫反应；参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。3表面标志物人NK细胞主要表达CD56和CD16（FcγRIII），不表达CD3。根据CD56表达强度，可分为CD56bright和CD56dim两个亚群，功能略有差异。其他特征性标志还包括NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D等。4吞噬细胞吞噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，主要包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等。它们通过识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs），迅速做出免疫反应。吞噬细胞的主要功能是吞噬并消化病原体、死亡细胞和异物；分泌细胞因子和趋化因子，调节炎症反应；部分吞噬细胞还能处理和提呈抗原，连接先天免疫和适应性免疫。在细胞分离技术中，常利用吞噬细胞的贴壁性和特异性表面标志物进行分离。抗原提呈细胞（APC）1专职APC树突状细胞是最有效的抗原提呈细胞，表达高水平的MHC和共刺激分子2次级APC巨噬细胞、B细胞等也具有抗原提呈能力，但效率较低3非专业APC其他组织细胞在特定条件下可表达MHC-I提呈抗原抗原提呈细胞是连接先天免疫和适应性免疫的桥梁，它们摄取外来抗原或自身异常蛋白，在细胞内进行加工处理，然后通过MHC分子将抗原肽段展示在细胞表面，提呈给T细胞识别。除了提呈抗原外，专业APC还表达CD80/CD86等共刺激分子和分泌细胞因子，提供T细胞活化所需的第二信号和第三信号。不同类型的APC有各自偏好的抗原摄取方式和处理途径，共同构成完整的抗原提呈网络。第二章：细胞分离的基本原理样本制备组织消化、单细胞悬液制备1初步富集密度梯度离心、红细胞裂解2特异性分离免疫亲和、流式分选、磁珠分选3纯度验证流式检测、功能分析4免疫细胞分离技术的核心原理是利用细胞之间的物理特性差异（如密度、大小、颗粒度）或生物学特性差异（如表面标志物表达），将目标细胞从混合细胞群中分离出来。现代细胞分离技术通常结合多种原理，采用多步骤策略：先通过物理方法进行初步富集（如从外周血中分离单个核细胞），再利用特异性方法进行精细分离（如从PBMC中分离特定的T细胞亚群）。这种策略既提高分离效率，又保证细胞纯度和活性。密度梯度离心法原理基于不同细胞类型密度差异，在离心力作用下，细胞在梯度介质中按密度大小分层。常用的梯度介质包括Ficoll、Percoll等，通常调整为特定密度（如1.077g/ml）。分离效果以Ficoll分离PBMC为例，离心后形成多层：上层为血浆，中间层（界面层）为单个核细胞和血小板，下层为梯度介质，底层为红细胞和粒细胞。收集界面层即可获得PBMC。操作要点梯度介质与稀释血液需小心分层；离心力、温度、加速和减速速率都需严格控制；离心后小心收集界面层，避免污染；分离后需多次洗涤去除残留梯度介质。免疫亲和分离法1免疫亲和分离特异性抗体与细胞表面标志物结合2基质固定抗体抗体固定在磁珠、柱子或培养皿上3靶细胞结合目标细胞与固定抗体特异性结合4非靶细胞洗脱非目标细胞被洗脱，靶细胞被保留5靶细胞回收通过洗脱缓冲液或酶切回收目标细胞免疫亲和分离法利用抗原-抗体特异性结合原理，使用特异性抗体（通常为单克隆抗体）识别并结合细胞表面特异性标志物，从而将目标细胞从混合细胞群中分离出来。根据操作模式，可分为正向分选（直接选择目标细胞）和负向分选（去除非目标细胞）。此方法是现代细胞分离技术的核心，具有特异性高、效率高、细胞活性保存好等优点。磁珠分选、流式细胞分选和亲和柱分离等技术都是基于免疫亲和原理的衍生技术。流式细胞分选法细胞染色用荧光标记的特异性抗体标记目标细胞表面分子，不同细胞亚群可用不同荧光标记，实现多参数分析。流式检测细胞悬液以单细胞流经激光束，每个细胞的散射光和荧光信号被探测器捕获，分析细胞理化特性和表面标志物表达。电荷分选根据预设门限，赋予目标细胞特定电荷，使其在电场中偏转，被收集到相应的收集管中，实现物理分选。收集分析分选后的细胞可进行纯度检测、功能分析或培养扩增。现代流式分选仪可实现多达18个参数同时分析，且保持高细胞活性。磁珠分选法原理利用包被特异性抗体的磁性微珠，与目标细胞表面抗原结合，在磁场作用下，标记细胞被吸附，非标记细胞流出，实现分离操作方式正向分选：直接标记并保留目标细胞；负向分选：标记并去除非目标细胞，收集未标记部分常见系统MACS系统（MiltenyiBiotec）：磁性微珠与分离柱配合使用Dynabeads（ThermoFisher）：直接磁性分离，不使用柱子优势操作简便，可同时处理大量样本，保持细胞活性，成本相对较低，可实现多参数分选局限性纯度可能低于流式分选，难以分离极低丰度细胞，依赖特异性抗体的质量第三章：外周血单个核细胞（PBMC）分离1定义和意义外周血单个核细胞（PBMC）是指外周血中的单核细胞、淋巴细胞和部分树突状细胞的总称，不包括红细胞、血小板和颗粒细胞。PBMC分离是大多数免疫细胞分离的第一步，也是最常用的基础细胞分离技术。2主要方法Ficoll密度梯度离心法是PBMC分离的金标准，基于不同血液成分密度差异，在离心力作用下实现分层分离。此外还有磁珠分离法、Leucosep离心管法等改良方法，适用于不同实验需求。3应用领域分离的PBMC可用于免疫学基础研究、疫苗开发、细胞因子检测、细胞治疗（如CAR-T）、药物筛选和毒性评价等多个领域。掌握PBMC分离技术是进行高级免疫细胞分离的前提。PBMC分离的原理PBMC分离的核心原理是利用血液各组分之间的密度差异。当使用密度为1.077g/ml的Ficoll分离液时，密度小于该值的细胞（如淋巴细胞和单核细胞）会位于分离液上方的界面处，而密度大于该值的细胞（如粒细胞和红细胞）则沉降到分离液下方。此外，分离过程还涉及血液与分离液的比例控制、离心力大小、离心时间、温度等多个影响因素。正确理解和控制这些因素，是获得高纯度、高活性PBMC的关键。Ficoll密度梯度离心法血液采集抗凝管采集新鲜血液1血液稀释用PBS1:1稀释抗凝血2分层加样轻轻铺在Ficoll分离液上3密度梯度离心800g离心30分钟，缓加缓停4收集界面吸取单核细胞层5Ficoll密度梯度离心法是分离PBMC最经典、最可靠的方法。其基本原理是利用Ficoll溶液的特定密度（通常为1.077g/ml），在离心力作用下，将血液中不同密度的组分分层。操作关键点包括：使用合适抗凝剂（如EDTA或肝素）采集血液；血液需1:1稀释以降低黏度；分层时需极其小心，避免混合；离心条件严格控制；收集界面层时需精准操作，避免吸入分离液或血浆。正确操作可获得约95%纯度的PBMC，活性>95%。PBMC分离步骤（1）1准备工作准备材料：新鲜全血（EDTA或肝素抗凝）、Ficoll分离液、PBS、无菌离心管、移液枪和吸头、离心机。所有操作在生物安全柜内进行，试剂预热至室温，确保无菌环境。2血液稀释将全血与等体积的PBS混合均匀（1:1稀释），稀释目的是降低血液黏度，防止红细胞聚集，提高分离效率。稀释液应轻柔混匀，避免产生气泡和细胞损伤。3分层加样在15ml离心管中加入3mlFicoll分离液，然后小心将稀释后的血液沿管壁缓慢滴加到Ficoll上层，保持两层界面清晰，不混合。或使用Leucosep管，先加Ficoll，离心后再加血液。PBMC分离步骤（2）1密度梯度离心将加样完成的离心管放入离心机，设置800g（约2000rpm），常温离心30分钟，加速和减速均设为最低档位，避免离心过程中层次混合。离心后可观察到清晰分层：上层为血浆，中间为浑浊的白色环状界面层（PBMC），下层为透明的Ficoll，底部为红细胞和粒细胞。2收集PBMC使用巴斯德吸管或移液器小心吸取界面层的PBMC，尽量少带血浆和Ficoll。将收集的细胞转移到新的15ml离心管中，加PBS至10ml，轻轻混匀，300g离心10分钟洗涤。弃上清，重悬细胞，再次洗涤1-2次，去除血小板和残留Ficoll。3细胞计数和质控最后一次洗涤后，用适量PBS或培养基重悬细胞。取少量细胞悬液与台盼蓝等量混合，在血球计数板上计数，确定细胞数量和活性。正常情况下，每毫升全血可获得约1-2×10^6个PBMC，活性应>95%。可通过流式细胞术进一步检测PBMC组分。PBMC分离注意事项样本处理血液样本应在采集后4小时内处理，过长时间会导致细胞活性下降。若无法及时处理，应在室温保存，避免冷藏（会激活中性粒细胞）。样本应轻柔混匀，避免剧烈震荡造成溶血。操作技巧分层加样是关键步骤，必须保持界面清晰。离心参数（速度、时间、加减速）需严格控制。收集界面层时要精准，避免吸入过多Ficoll或血浆。洗涤次数不应少于2次，确保去除残留分离液和血小板。常见问题分离后回收率低：可能是血液保存不当、离心参数不适或收集不完全。红细胞污染：可能是分层不清、离心参数不当或红细胞脆性增加。细胞活性差：可能与样本质量、操作时间过长或机械损伤有关。细胞保存分离的PBMC可立即使用，或在4℃短暂保存（<24小时）。长期保存需使用冻存液（含10%DMSO的血清）缓慢冷冻至-80℃或液氮中。冻存前，细胞浓度应控制在1-2×10^7/ml，确保冻存效果。第四章：T细胞分离技术重要性T细胞是适应性免疫的核心细胞，在免疫监视、抗感染和抗肿瘤免疫中发挥关键作用。分离高纯度、功能完整的T细胞对免疫学研究和细胞治疗（如CAR-T）至关重要。从PBMC中分离T细胞是常见的免疫细胞分离任务。分离策略T细胞分离通常采用两步策略：先通过密度梯度离心法获得PBMC，再基于T细胞特异性表面标志（如CD3、CD4、CD8）进行免疫分选。主要分离方法包括磁珠分选法和流式细胞分选法，可根据实验需求选择正向分选或负向分选。挑战与发展T细胞分离的主要挑战在于保持细胞的功能活性和表型稳定性。近年来，封闭式自动化分离系统和基于微流控技术的新方法不断涌现，提高了分离效率和细胞质量，促进了T细胞在基础研究和临床应用中的广泛使用。T细胞表面标志物T细胞表面表达多种特征性分子，这些分子不仅是T细胞鉴定和分类的标志，也是T细胞分离的主要靶点。所有成熟T细胞都表达CD3分子复合物和T细胞受体（TCR），因此CD3通常作为全部T细胞的标志物。根据共受体表达，T细胞可分为CD4+和CD8+两大亚群。CD4+T细胞主要识别MHC-II提呈的抗原，包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞（Treg，表达CD25和Foxp3）等。CD8+T细胞识别MHC-I提呈的抗原，主要发挥细胞毒性作用。此外，记忆T细胞和效应T细胞可通过CD45RA/CD45RO等标志物区分。磁珠分选T细胞（原理）正向分选使用抗CD3抗体标记的磁珠直接标记T细胞，在磁场中保留标记细胞，非标记细胞流出。优点是操作简单，缺点是分离的T细胞表面结合有抗体，可能影响后续功能研究。负向分选使用抗非T细胞标志物（如CD14、CD16、CD19、CD56等）的抗体混合物，标记并去除非T细胞，未标记的T细胞流出。优点是获得的T细胞表面无抗体干扰，缺点是纯度可能略低。两步分选先进行全T细胞分离，再分离特定亚群。例如，先使用抗CD3磁珠获得全T细胞，再使用抗CD4或CD8磁珠进一步分离亚群。此方法适用于低丰度亚群分离，可提高纯度和特异性。磁珠分选T细胞（步骤）样本准备从外周血中分离PBMC，计数后调整细胞浓度至1×10^7/ml。使用冰冷的分选缓冲液（含2%FBS和2mMEDTA的PBS）重悬细胞。细胞应新鲜，活性>90%，避免反复冻融。磁珠标记以负向分选为例：将细胞悬液与生物素标记的抗非T细胞抗体混合物（抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD56等）孵育15分钟。洗涤后，加入抗生物素磁珠，4℃孵育15分钟。期间轻轻混匀，避免细胞沉降。磁场分离将标记细胞悬液加入预湿润的分离柱（放置在磁铁架上）。未标记的T细胞流出收集。用缓冲液洗涤柱子3次，确保所有未标记T细胞洗脱。若需高纯度，可使用两个连续柱子进行二次分离。质量控制分离后进行细胞计数和活性检测。使用流式细胞术检测T细胞纯度（CD3+比例）和亚群分布（CD4+、CD8+比例）。分析分离效率（回收率=获得T细胞数/理论T细胞数×100%）。典型纯度应>95%，回收率>90%。流式分选T细胞99.9%纯度流式分选可基于多参数精确选择目标细胞90%活性优化的分选参数可保持细胞功能完整80%回收率典型的T细胞流式分选回收效率4h操作时间单次分选处理1×10^7细胞所需时间流式细胞分选是基于荧光激活细胞分选（FACS）原理的高精度分离技术，能够同时分析多种细胞表面标志物，实现更精细的T细胞亚群分离。典型的T细胞流式分选步骤包括：细胞标记（使用荧光抗体如CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC等）；流式检测和设置分选门；电荷赋予和物理分选；收集分选细胞和质量控制。与磁珠分选相比，流式分选的优势在于多参数分析能力强，可分离极低丰度亚群，纯度极高；劣势在于操作复杂，设备昂贵，速度较慢，不适合大规模细胞分离。流式分选特别适用于研究性分离和稀有亚群（如记忆干细胞）分离。T细胞亚群分离T细胞亚群分离是在全T细胞分离基础上的进一步精细分离，通常基于特定亚群的表面标志物。常见的T细胞亚群分离包括：CD4+T细胞（辅助T细胞）分离，使用抗CD4抗体；CD8+T细胞（细胞毒性T细胞）分离，使用抗CD8抗体；Treg细胞分离，使用CD4+CD25+CD127低表达作为标志。T细胞亚群分离可采用直接从PBMC一步分离或从预先富集的T细胞中二次分离两种策略。对于低丰度亚群（如Treg、Th17等），推荐采用二步法，先富集总T细胞，再分离特定亚群。分离方法仍以磁珠分选和流式分选为主，具体选择取决于纯度要求、细胞数量和下游应用。第五章：B细胞分离技术1分离意义B细胞是体液免疫的主要执行者，负责产生抗体和建立体液免疫记忆。分离纯B细胞对于研究抗体反应、疫苗评价、自身免疫疾病机制和B细胞淋巴瘤治疗等领域至关重要。高纯度B细胞是研究抗原特异性免疫反应和抗体基因库构建的基础。2分离难点B细胞在外周血中比例相对较低（约5-15%的PBMC），且不同个体和生理状态下波动较大。B细胞表面标志物种类多，不同分化阶段表达谱差异大。某些B细胞亚群（如记忆B细胞）极度稀少，需特殊技术分离。3分离策略B细胞分离通常采用两步策略：先分离PBMC，再基于B细胞特异性表面标志物（如CD19、CD20、CD22）进行分选。磁珠分选和流式分选是主要方法，临床级分离还可使用纤维素柱吸附或自动化封闭系统。B细胞表面标志物CD19B细胞系最广泛的标志物，从前B细胞到浆细胞前阶段均表达。作为B细胞共受体复合物的成员，参与信号转导。CD19是B细胞分离最常用的靶分子，几乎所有B细胞分离试剂盒都使用抗CD19抗体。CD20成熟B细胞表面表达的钙通道蛋白，从前B细胞晚期到浆细胞前阶段表达，浆细胞不表达。广泛用于B细胞淋巴瘤的靶向治疗（如利妥昔单抗）。也可用作B细胞分离的靶分子，但覆盖范围略窄于CD19。膜表面免疫球蛋白（mIg）B细胞受体的主要组成部分，成熟B细胞表达IgM和IgD，记忆B细胞可表达IgG、IgA或IgE。不同阶段B细胞表达不同类型和水平的mIg，可用于区分不同B细胞亚群，如初始B细胞和记忆B细胞。磁珠分选B细胞1细胞准备从外周血或淋巴组织获取单细胞悬液，若为外周血，需先分离PBMC。计数并调整细胞浓度至1×10^7/ml，使用含2%FBS和2mMEDTA的PBS作为分选缓冲液。确保细胞新鲜、活性高，且充分混匀成单细胞悬液。2分选策略选择可选择正向分选（直接标记CD19+B细胞）或负向分选（标记非B细胞）。正向分选操作简单，纯度高；负向分选可避免激活B细胞或影响其功能。根据下游研究需求选择合适策略，如功能研究优先选负向分选。3磁珠标记根据所选策略，加入相应磁珠标记的抗体。正向分选使用抗CD19磁珠；负向分选使用抗非B细胞标志物（CD3、CD14、CD16等）的抗体混合物。在4℃条件下孵育15-30分钟，期间轻轻混匀，避免细胞沉降。4磁场分离与质检将标记细胞悬液加入置于磁铁架上的分离柱。对于正向分选，洗脱后移除磁铁，用缓冲液冲洗收集CD19+细胞；对于负向分选，直接收集流出液中的未标记B细胞。分离后进行计数、活性检测和纯度分析（流式检测CD19+比例，应>95%）。流式分选B细胞荧光标记将PBMC或淋巴组织单细胞悬液与荧光标记的B细胞特异性抗体（如CD19-PE、CD20-APC）和排除标记（如7-AAD用于排除死细胞）混合孵育。若需分离特定B细胞亚群，可使用多色组合，如CD19+IgD+CD27-（初始B细胞）或CD19+IgD-CD27+（转换记忆B细胞）。仪器设置在流式细胞仪上设置适当参数，包括散射光（前向散射FSC和侧向散射SSC）和荧光通道。进行单染和FMO（FluorescenceMinusOne）对照，确定阳性群体的准确门限。设置适当的分选速度和压力，平衡细胞纯度和回收率。细胞分选确认门位置后，开始细胞分选。对于常规B细胞分选，首先通过FSC/SSC选取淋巴细胞群体，排除细胞碎片；然后选择活细胞（7-AAD阴性）；最后根据CD19或CD20表达选择B细胞。分选的细胞直接收集到含培养基的管中。质量验证分选后取少量细胞进行复检，确认纯度（CD19+比例通常可达>99%）。计数分选细胞数量，计算回收率。回收的B细胞可直接用于下游实验，如功能研究、RNA提取、单细胞测序或体外培养。B细胞亚群分离初始B细胞记忆B细胞边缘带B细胞浆细胞母细胞调节性B细胞B细胞根据发育阶段和功能特点可分为多个亚群，不同亚群在免疫反应中发挥不同作用。主要B细胞亚群包括：初始B细胞（CD19+IgD+CD27-）：未经抗原刺激的成熟B细胞；记忆B细胞（CD19+CD27+）：经抗原刺激并产生记忆的B细胞，可进一步分为IgM记忆B细胞和转换记忆B细胞；浆母细胞（CD19+CD38++）：正在分化为浆细胞的B细胞；边缘带B细胞（CD19+IgM+IgD+CD27+）：介于先天和适应性免疫之间的B细胞。B细胞亚群分离主要依靠流式分选技术，利用多色标记区分不同亚群。对于临床应用，也可使用连续磁珠分选策略，先富集总B细胞，再基于特定标志物分离亚群。B细胞亚群分离对研究免疫记忆、疫苗效果和B细胞相关疾病机制具有重要价值。第六章：NK细胞分离技术1234临床意义NK细胞具有直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的能力，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。高纯度NK细胞的分离是NK细胞治疗（如过继性NK细胞输注、CAR-NK细胞）的关键环节。分离挑战NK细胞在外周血中比例较低（约占PBMC的5-15%），且与部分T细胞亚群（NKT细胞）表型重叠。成熟NK细胞易被激活，分离过程可能影响其功能。部分NK细胞亚群极为稀少，需特殊技术分离。主要方法NK细胞分离主要基于其特征性表面标志物（如CD56+CD3-），采用磁珠分选或流式分选技术。临床规模NK细胞分离可使用自动化系统，如CliniMACS等。体外扩增是获取大量NK细胞的补充策略。应用方向分离的NK细胞可用于基础研究（如杀伤机制研究）、药物筛选（如检测药物对NK细胞功能的影响）和临床治疗（如过继性NK细胞治疗、CAR-NK细胞治疗）等多个领域。NK细胞表面标志物标志物表达特点分离中的应用CD56几乎所有人NK细胞表达，表达强度可分为CD56bright和CD56dim两个亚群NK细胞分离的主要阳性标志物CD16大多数NK细胞表达（主要是CD56dim亚群），介导ADCC部分NK细胞分离方案中的辅助标志物CD3NK细胞不表达CD3，T细胞表达NK细胞分离的主要排除标志物，区分NK和NKT细胞NKp46NK细胞特异性激活受体，表达相对稳定CD56表达异常时的替代标志物NKG2DNK细胞上表达的主要激活受体之一NK功能研究的重要标志物磁珠分选NK细胞正向分选使用抗CD56磁珠直接标记NK细胞，在磁场中保留标记细胞。优点是操作简单，纯度较高；缺点是可能共同分选出少量NKT细胞（CD56+CD3+），且抗体结合可能影响CD56分子功能。适用于对纯度要求不是极高的应用。负向分选使用抗非NK细胞标志物（CD3、CD14、CD19等）抗体混合物，标记并去除非NK细胞。优点是分离的NK细胞表面无抗体结合，功能保持完整；缺点是纯度可能略低于正向分选，且成本较高。推荐用于功能研究和细胞治疗。两步分选先去除明确的非NK细胞（如红细胞、单核细胞），再进行NK细胞特异性分选。例如，先通过Ficoll分离PBMC，再进行NK特异性磁珠分选。或先用抗CD3磁珠去除T细胞，再用抗CD56磁珠分选NK细胞。这种策略可提高纯度和回收率。临床级分离使用符合GMP要求的封闭式系统（如MiltenyiCliniMACS或Cytochrome大规模分离系统）进行自动化分离。这些系统使用临床级试剂，可处理大量起始材料（如白细胞单采产物），获得足够临床使用的NK细胞，纯度和活性符合临床要求。流式分选NK细胞流式分选是分离高纯度NK细胞及特定NK亚群的金标准方法。基本流程包括：样本制备（通常从PBMC开始）；荧光抗体标记（典型组合为CD56-PE、CD3-FITC和CD16-APC，加7-AAD排除死细胞）；流式仪器参数设置和门限确定；细胞分选和收集；质量控制和下游应用。典型的NK细胞流式分选策略是：首先通过FSC/SSC选择淋巴细胞群体；排除死细胞（7-AAD阴性）；选择CD3-CD56+群体作为NK细胞；必要时可进一步根据CD56表达强度和CD16表达分离NK亚群（CD56brightCD16-和CD56dimCD16+）。分选后的NK细胞纯度通常可达99%以上。流式分选的优势在于能够精确区分细微的表型差异，分离特定功能的NK亚群，且可同时分选多个不同群体。缺点是处理量有限，不适合大规模分离；设备和操作要求高。流式分选特别适用于研究性分离和稀有NK亚群（如组织驻留NK细胞）的分离。NK细胞纯度检测流式细胞术检测最常用的NK细胞纯度检测方法。典型组合使用CD56和CD3双染色，NK细胞表现为CD56+CD3-。高质量分离应达到>90%的CD56+CD3-比例。可添加CD16、CD45等标志物进行多参数分析，或使用NKp46、NKG2D等功能分子评估NK细胞亚群分布。免疫荧光显微镜用荧光标记的抗CD56和抗CD3抗体染色细胞，在荧光显微镜下观察。NK细胞表现为CD56阳性（通常呈膜表达）、CD3阴性。此方法直观但通量低，主要用于少量样本的形态学确认和空间分布研究，不适合常规纯度检测。功能验证通过功能测试间接评估NK细胞纯度和质量。常用方法包括细胞毒性实验（如对K562细胞的杀伤活性）、细胞因子分泌检测（如IFN-γ、TNF-α产生）和脱颗粒反应（CD107a表达）。高活性是纯度高、质量好的NK细胞的重要指标。第七章：树突状细胞（DC）分离技术1研究价值树突状细胞是最强大的专职抗原提呈细胞，是连接先天免疫和适应性免疫的桥梁。它们不仅是基础免疫学研究的重要对象，也是肿瘤疫苗和细胞治疗的关键工具。分离和培养高质量的DC对免疫治疗的成功至关重要。2分离挑战DC在外周血和组织中含量极低（外周血中<1%的白细胞），且存在多种亚型，形态和表型各异。不同组织中的DC表面标志物表达谱存在差异，难以用统一标准分离。DC极易受到分离过程的刺激而改变表型和功能。3主要策略DC分离主要采用三种策略：直接从组织或血液中分离天然DC；从CD34+造血干细胞诱导分化DC；从单核细胞体外诱导分化为单核细胞衍生DC（MoDC）。其中第三种方法最为常用，特别是在临床应用中。DC的类型和特征树突状细胞是一类异质性细胞群体，根据发育来源、组织分布和功能特点可分为多个亚型。主要包括：经典DC（cDC），又分为cDC1（CD141+）和cDC2（CD1c+），前者专长于交叉提呈，后者激活CD4+T细胞；浆细胞样DC（pDC），表达CD123和CD303，是I型干扰素的主要产生者；Langerhans细胞，主要分布在表皮，表达Langerin；单核细胞衍生DC（MoDC），炎症条件下从单核细胞分化而来。不同亚型DC表达不同的识别受体、细胞因子谱和共刺激分子，在免疫应答中发挥不同作用。分离特定亚型DC对研究其功能特点和开发针对性免疫治疗具有重要意义。外周血DC分离PBMC制备从健康供者外周血中通过Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。DC在外周血中比例极低（约占PBMC的0.5-2%），需要大量起始血液（通常>100ml）才能获得足够数量的DC用于研究。富集策略由于DC比例低，通常需要先进行预富集，去除主要的非DC细胞群。常用方法包括：贴壁法去除单核细胞；抗体鸡尾酒（抗CD3、CD14、CD16、CD19等）负向选择去除T细胞、单核细胞、NK细胞和B细胞；密度梯度进一步分离低密度细胞。特异性分离DC亚型特异性分离主要基于特征性表面标志物。pDC可使用抗CD123或CD303(BDCA-2)抗体分离；cDC1使用抗CD141(BDCA-3)抗体；cDC2使用抗CD1c(BDCA-1)抗体。分离方法可采用磁珠分选或流式分选，后者纯度更高但通量较低。质量评估分离后的DC需要进行纯度和功能验证。纯度评估通常采用流式细胞术检测特异性标志物表达；功能验证包括形态学观察（特征性树突）、混合淋巴细胞反应（刺激T细胞增殖能力）、细胞因子产生谱和抗原呈递能力等。体外诱导DC分化1单核细胞分离从PBMC中分离单核细胞，可采用贴壁法、密度梯度法或CD14磁珠分选法。CD14磁珠分选纯度最高，但成本也最高。贴壁法简便经济，但纯度较低。典型的单核细胞纯度应>90%，细胞活性>95%。2分化培养将纯化的单核细胞以密度0.5-1×10^6/ml接种于含10%FBS的RPMI-1640完全培养基中，添加GM-CSF(50-100ng/ml)和IL-4(20-50ng/ml)诱导分化为未成熟DC。培养物每2-3天添加新鲜细胞因子，总培养时间约5-7天。3DC成熟诱导未成熟DC具有强抗原摄取能力但抗原提呈能力弱。要获得功能完整的成熟DC，需添加成熟刺激物，如LPS(100ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)和IL-6(15ng/ml)的"细胞因子鸡尾酒"，或CD40L等，刺激24-48小时。4收获与功能验证成熟DC呈典型的星形或树枝状形态，半贴壁生长。轻轻吹打即可收获。验证成熟标志物表达（CD80、CD83、CD86和MHC-II高表达）和功能特性（低抗原摄取能力、高T细胞刺激能力和高水平IL-12产生）。DC纯度和成熟度检测形态学观察成熟DC呈典型的不规则形态，有丰富的胞质突起或"树突"。光学显微镜下可观察细胞形态；电子显微镜可观察更详细的超微结构，包括丰富的内质网、溶酶体和MHC-II小泡等。表面标志物检测流式细胞术是评估DC纯度和成熟度的主要方法。典型的DC标志物包括CD11c、HLA-DR（高表达）、CD14（低/不表达）和特定亚型标志物。成熟DC高表达CD80、CD83、CD86和CCR7，低表达CD1a和CD207。功能测试功能测试是DC质量的最终评估。包括：混合淋巴细胞反应（MLR），检测刺激同种异体T细胞增殖的能力；抗原特异性T细胞激活试验；细胞因子分泌谱分析（如IL-12p70、IL-10等）；抗原摄取能力（如胞饮FITC-Dextran）。第八章：巨噬细胞分离技术巨噬细胞是组织中的专职吞噬细胞，由循环单核细胞迁移到组织后分化而来。它们在先天免疫防御、炎症调节、组织修复和抗原提呈等方面发挥重要作用。不同组织中的巨噬细胞具有特定名称和功能特点，如肺泡巨噬细胞、Kupffer细胞、小胶质细胞和骨髓巨噬细胞等。巨噬细胞分离的主要挑战在于：组织巨噬细胞与组织基质结合紧密，需要特殊方法分离；不同组织巨噬细胞表型和功能存在明显异质性，难以用统一方法分离；巨噬细胞易被机械刺激和消化酶激活，影响功能研究；组织中巨噬细胞数量有限，难以获得大量纯细胞。根据来源不同，巨噬细胞分离可分为三类：直接从组织中分离原代巨噬细胞；从外周血单核细胞体外诱导分化；使用巨噬细胞系细胞（如THP-1、RAW264.7等）。本章将重点介绍前两种方法，特别是常用的腹腔巨噬细胞和肺泡巨噬细胞的分离技术。巨噬细胞的来源和特征1组织特异性巨噬细胞适应特定组织微环境的专职吞噬细胞2炎症巨噬细胞由循环单核细胞迁移分化而来3组织驻留巨噬细胞胚胎期定居，可自我更新维持4单核细胞循环中的前体细胞5骨髓祖细胞单核细胞-巨噬细胞系统的起源巨噬细胞是一类高度异质性的免疫细胞，根据发育来源可分为两大类：组织驻留巨噬细胞，起源于胚胎卵黄囊或胎肝祖细胞，在组织中长期维持并自我更新，如小胶质细胞、Langerhans细胞等；炎症巨噬细胞，由骨髓源性单核细胞在炎症条件下迁移到组织后分化而来。巨噬细胞根据激活状态可分为M1型（经典活化，促炎症）和M2型（替代活化，抗炎症）。不同极化状态的巨噬细胞表达不同的表面标志物、分泌不同的细胞因子，发挥不同的功能。在分离和研究巨噬细胞时，需考虑其来源和极化状态的影响。腹腔巨噬细胞分离1腹腔细胞收集腹腔巨噬细胞分离通常使用小鼠或大鼠作为来源。可采集静息状态（未刺激）的腹腔巨噬细胞，或通过硫糖铝(2ml4%)、淀粉糊精或刀豆蛋白A等刺激物注射腹腔3-4天后收集募集的巨噬细胞（数量更多）。麻醉动物后，暴露腹部，用含5-10mMEDTA的冰冷PBS5-10ml灌洗腹腔2-3次，收集腹腔液。2巨噬细胞富集腹腔细胞悬液含有巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞等多种细胞。利用巨噬细胞的贴壁特性进行富集：将细胞悬液接种于培养板中，37℃培养1-2小时，非贴壁细胞用PBS洗去，剩余贴壁细胞主要为巨噬细胞（纯度约70-80%）。或使用密度梯度离心法初步富集巨噬细胞。3纯化与鉴定若需更高纯度，可使用磁珠分选（抗F4/80或CD11b抗体）或流式分选（F4/80+CD11b+）。分离的巨噬细胞可通过形态学观察（大型单核细胞，丰富的胞质），特异性标志物表达（F4/80、CD11b、CD68等）和功能测试（吞噬能力、NO产生、细胞因子分泌等）进行鉴定。肺泡巨噬细胞分离支气管肺泡灌洗肺泡巨噬细胞主要通过支气管肺泡灌洗（BAL）收集。麻醉动物（小鼠/大鼠）或利用人体肺叶切除标本，插管气管，用冰冷PBS反复灌洗肺泡（小鼠约0.8ml×3次，大鼠约5ml×3次），收集灌洗液。正常肺泡灌洗液中90-95%的细胞为肺泡巨噬细胞。肺组织消化对于深层肺巨噬细胞，需进行肺组织消化。将肺脏灌注清除血液，剪碎组织，用含消化酶混合物（胶原酶I、分散酶II和DNaseI）的培养基消化30-45分钟。通过70μm细胞筛过滤获得单细胞悬液。消化法获得的巨噬细胞包含肺泡和间质两种类型。纯化与鉴定初步获得的细胞可通过贴壁培养（1-2小时）富集巨噬细胞。更高纯度需使用磁珠分选（人CD14/小鼠F4/80或CD11c）或流式分选（人：CD45+CD206+/小鼠：CD11c+Siglec-F+）。肺泡巨噬细胞呈圆形或椭圆形，胞质丰富，含自体荧光；可通过吞噬测试、表面标志物检测和细胞因子分泌谱鉴定。巨噬细胞的体外培养1培养条件巨噬细胞通常在含10-15%血清（FBS或自体血清）的RPMI-1640或DMEM培养基中培养。可添加抗生素防止污染，但应注意某些抗生素（如庆大霉素）可影响巨噬细胞功能。培养板通常预先涂布胞外基质蛋白（如纤连蛋白）以促进贴壁和存活。培养温度37℃，5%CO2，湿度>95%。2体外诱导分化从外周血单核细胞诱导分化巨噬细胞是常用方法。将纯化的CD14+单核细胞（1×10^6/ml）培养在含M-CSF(50-100ng/ml)的完全培养基中5-7天。M1型巨噬细胞可通过LPS和IFN-γ诱导，M2型通过IL-4和IL-13诱导。不同诱导条件产生的巨噬细胞表型和功能存在差异。3功能维持巨噬细胞体外培养的主要挑战是维持其功能稳定性。原代巨噬细胞通常不适合长期培养（>1周），随着培养时间延长，其表型和功能会发生显著变化。若需长期研究，建议使用巨噬细胞系（如THP-1、U937、RAW264.7等）或从造血干/祖细胞诱导。第九章：免疫细胞分离后的纯度检测免疫细胞分离后的纯度检测是确保实验可靠性和重复性的关键步骤。无论采用何种分离方法，都需要通过客观定量的方法确认分离细胞的身份、纯度和活性。纯度检测不仅能验证分离技术的有效性，也是质量控制的重要环节。常用的纯度检测方法包括：流式细胞术（最常用，可定量分析特异性标志物表达）；免疫细胞化学/免疫荧光染色（可观察标志物表达和细胞形态）；分子生物学方法（RT-PCR检测特异性基因表达）；功能测试（验证细胞特征性功能）。对于临床应用，通常需要多种方法综合评估，确保细胞产品符合质量标准。流式细胞术检测原理细胞标记荧光抗体与细胞表面标志物结合1激光激发单细胞流过激光束被激发产生荧光2信号检测散射光和荧光被检测器捕获转换为电信号3数据分析软件处理生成点图和直方图显示细胞特性4流式细胞术是免疫细胞纯度检测的首选方法，能够在单细胞水平同时分析多个参数。其基本原理是利用荧光标记的抗体特异性识别细胞表面或胞内分子，在激光照射下产生荧光信号，由检测器捕获并转换为数字信号进行分析。现代流式细胞仪通常具有多个激光器和检测器，可同时检测10-30个参数。检测免疫细胞纯度时，通常选择该细胞类型的特征性标志物（如T细胞的CD3、B细胞的CD19等）和排除标志物（其他细胞类型的标志物），结合活死细胞染料，全面评估分离细胞的纯度、亚群组成和活性。免疫荧光染色步骤细胞准备收集分离的细胞，用PBS洗涤，调整浓度至约1×10^6/ml。制备细胞涂片（离心沉淀或细胞离心机）或贴壁培养于载玻片上。必要时进行固定（4%多聚甲醛10分钟）和通透（0.1%TritonX-100，仅检测胞内抗原时需要）。封闭与标记使用封闭液（含5-10%血清的PBS）室温封闭30分钟，减少非特异性结合。加入稀释适当的荧光标记一抗（如抗CD3-FITC、抗CD19-PE等），4℃孵育2小时或过夜。用PBS-T洗涤3次，每次5分钟。若使用非标记一抗，需进一步孵育荧光标记二抗。核染色与封片加入核染料（如DAPI，1μg/ml）染色细胞核，室温5分钟。PBS洗涤后，使用抗淬灭封片剂封片。封片干燥后，在荧光显微镜下观察并拍照。荧光通道选择应与所用荧光染料匹配，避免光谱重叠。结果分析计算特定标志物阳性细胞比例（阳性细胞数/总细胞数×100%）作为纯度指标。观察细胞形态和标志物表达模式，判断细胞身份。合格的分离样本通常要求目标细胞纯度>90%（研究用途）或>95%（临床用途）。必要时拍摄多个视野进行统计分析。流式细胞仪操作要点仪器准备启动流式细胞仪，让系统稳定30分钟。进行日常清洗和灭菌程序。校准仪器，使用单染色对照调整补偿，消除荧光通道间干扰。如有必要，使用荧光微球校准荧光强度，确保不同批次数据可比。样本制备分离的细胞悬浮于FACS缓冲液（含2%FBS和2mMEDTA的PBS）中。细胞数应适中（0.5-1×10^6/样本），避免过多（堵塞）或过少（统计不足）。准备单染色对照和FMO（FluorescenceMinusOne）对照，用于设置补偿和门限。数据采集设置合适的阈值和收集速度，通常控制在1000-3000个事件/秒，避免过快导致多细胞聚集。收集足够数量的事件（通常至少10,000个，对稀有群体至少100个），确保统计意义。实时观察散点图，检查是否有异常模式。分析策略使用FSC/SSC识别细胞群体，排除碎片。用活死染料（如7-AAD、PI）或FSC-A/FSC-H排除死细胞和聚集。根据关键标志物表达确定目标细胞群体。计算目标细胞比例和绝对数量。结果通常以比例、平均荧光强度(MFI)或直方图表示。数据分析和解释纯度评估纯度计算方法：目标细胞数/总有效细胞数×100%。例如，T细胞分离后的纯度为CD3+细胞百分比，B细胞分离后的纯度为CD19+细胞百分比。研究用途纯度要求通常>90%，临床应用通常要求>95%。同时应关注污染细胞的类型和比例，某些污染（如死细胞）影响较小，而其他污染（如激活细胞）可能严重干扰实验。活性与功能除纯度外，还应评估细胞活性（通常用7-AAD或PI排除死细胞）和功能状态。功能状态可通过特定标志物表达反映，如T细胞活化标志（CD25、CD69）、B细胞活化标志（CD80、CD86）或NK细胞活化受体表达（NKG2D、NKp46）。功能检测可结合增殖实验、细胞因子分泌或特异性杀伤活性等。亚群分析多参数分析可进一步评估分离细胞的亚群组成。例如，T细胞分离后可分析CD4+/CD8+比例、记忆/初始T细胞比例，或Treg细胞比例；B细胞可分析初始/记忆B细胞比例；DC可分析成熟度标志表达。亚群组成分析有助于更全面理解分离细胞的功能特点和潜在应用价值。第十章：分离细胞的功能检测1细胞活性检测验证细胞是否存活并保持基本代谢功能2表型稳定性检测确认细胞保持原有表面标志物表达谱3功能应答测试评估细胞对特定刺激的反应能力4特异性功能验证检测不同免疫细胞类型的特征性功能免疫细胞分离后的功能检测是评估分离质量的重要环节，也是确保下游实验可靠性的必要步骤。分离过程可能对细胞功能产生影响，如表面抗体结合可能激活或抑制细胞，机械应力可能导致细胞应激，而分离试剂残留可能干扰细胞信号传导。功能检测的选择应根据细胞类型和研究目的确定。基本检测包括细胞活性（MTT/CCK-8或台盼蓝排斥）和应激状态（热休克蛋白表达或活性氧水平）。特异性功能检测则针对各类免疫细胞的特征性功能，如T细胞的增殖和细胞因子分泌、B细胞的抗体产生、NK细胞的杀伤活性和DC的抗原提呈能力等。T细胞增殖实验24h刺激时间T细胞完全活化所需最短时间72h增殖高峰CD3/CD28刺激后增殖达峰时间2-4增殖倍数健康T细胞72小时内的典型增殖倍数95%活性标准功能完整T细胞的最低增殖应答率T细胞增殖实验是评估分离T细胞功能完整性的基本方法。主要刺激方式包括：非特异性丝裂原刺激（如PHA、ConA）；抗CD3/CD28抗体刺激（模拟TCR信号）；同种异体混合淋巴细胞反应（MLR，反映对异体MHC的反应）；抗原特异性刺激（对特定抗原的记忆T细胞反应）。增殖检测方法主要有：CFSE标记法（通过细胞分裂稀释荧光强度评估增殖代数）；3H-胸腺嘧啶核苷掺入法（测量DNA合成）；MTT/CCK-8法（测量代谢活性）；BrdU掺入法（检测新合成DNA）；Ki-67表达检测（增殖标志物）。功能完整的T细胞应表现出剂量依赖的增殖反应和细胞因子（如IL-