常规组织病理技术VIP

第二章常规组织病理技术活体组织检验:活检目帮助临床对病变作出诊疗或为疾病诊疗提供线索了解病变性质、发展趋势,判定疾病预后验证及观察药品疗效,为临床用药提供参考依据参与临床科研,发觉新疾病或新类型,为临床科研提供病理组织学依据活检应用范围帮助临床对病变作出诊疗或为疾病诊疗提供线索了解病变性质、发展趋势,判定疾病预后。验证及观察药品疗效,为临床用药提供参考依据参与临床科研,发觉新疾病或新类型,为临床科研提供病理组织学依据活检标本类型手术摘除器官、组织,如阑尾、甲状腺、胆囊、淋巴结等穿刺抽取组织,如肝、肾、淋巴结穿刺组织自病变部位切取小块组织,包含用纤维胃镜、纤维支气管镜等内镜钳取病变组织刮取组织:刮出子宫内膜组织（诊刮）,外科手术刮取病变骨组织等活体组织标本固定与送检固定存放送检组织与细胞取材一张好切片是确保病理诊疗和科研结果正确性前提和基础与正确取材、适宜固定和良好染色亲密相关组织处理要求完整保留组织细胞形态最大程度保留组织或细胞成份抗原性抗原不弥散,以确保其正确定位组织取材（一）通常标准厚度0.2～0.3cm;面积1～1.5cm2较薄皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条缠绕成同心圆状骨组织需先经脱钙处理若需保留新鲜组织,应将所取组织用锡箔纸包好,浸入液氮速冻,然后置-70℃冰箱中（二）取材注意事项刀剪应锋利、避免前后拉动和挤压避免使用有齿镊,动作轻柔以免挫伤或挤压组织避开坏死组织和血凝块,去掉异物取病变主体、病变与正常交界和正常组织各一块固定及常见固定剂一、概念:将组织浸入一些化学试剂中,使组织细胞内物质能尽可能保持其生活状态时形态结构和位置二、固定作用1.保持组织、细胞与生活状态时相同结构和形态,预防组织自溶和细菌繁殖造成组织腐败2.保持细胞内蛋白质等成份凝固并定位于原有部位3.便于区分不一样组织成份:固定可使组织细胞中多种成份沉淀、凝固并易着色4.有利于切片:固定剂兼有组织硬化作用,能使组织细胞从半液体状变为半固体状5.有利于免疫组化染色和核酸原位杂交:完整保留及正确定位抗原、DNA和RNA成份三、组织固定注意事项1.取材后要立刻固定,尤其是温度高季节,以免腐败2.容器:最好选择广口容器,一是避免组织受挤压变形,二是方便取材时易于取出3.固定液要足量,最少应为组织块总体5倍以上4.依据不一样研究目选择不一样固定液Masson染色,最好用甲醛升汞、Zenker液或bouin液固定保留细胞内糖原应选择Carnoy液固定显示尿酸盐结晶可用100%酒精固定5.固定时间:视组织块大小、固定温度、固定液种类而定通常固定6小时以上,然后保留于70%酒精中温度低于4℃时,固定时间应延长比较大标本除延长固定时间外,还应做多个切面固定,以免固定不均匀四、固定方法1.浸泡法2.蒸汽固定法:常见于固定组织中可溶性物质3.灌注固定法:用于组织块过大或固定剂难以进入其内部标本（如整个器官、整只动物）4.滴加法:细胞涂片5.微波固定法（63℃～65℃）:含有核膜清楚、染色质均匀、组织结构收缩小等优点,但因为其固定时间不易掌握,通常不主张利用于小组织块固定常见固定液及其配制（一）单纯固定液:由单一化学物质组成1.甲醛（1）优点:价格廉价、组织穿透力强、固定均匀、组织收缩小,可长久保留标本（2）缺点:易挥发,有一定毒性（3）性质:交联性组织固定剂（4）适用范围:适合多个特殊染色,对脂类和类脂体、神经及髓鞘都有良好固定效果;也可固定高尔基体、线粒体和糖类（5）使用浓度:10%formalin,即10ml市售原液（40%）加90ml水,此液甲醛实际浓度为4%2.中性甲醛以pH7.2～7.4磷酸缓冲液（PBS）为溶剂配制甲醛溶液,浓度同前优点:固定效果及对组织抗原保留均优于通常甲醛溶液是科研用组织最常见固定液3.乙醇（1）优点:含有硬化、固定、脱水等作用,还能保留糖原和尿酸结晶（2）使用浓度:固定组织用80%～95%为好,70%乙醇可用于保留组织;证实尿酸结晶和保留糖原用100％浓度（3）缺点:组织渗透力较弱能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,核蛋白沉淀后能溶于水,使核染色不良高浓度乙醇固定组织硬化显著,组织收缩显著且脆,既影响切片,又致组织形态改变,影响诊疗溶解脂肪、类脂质和血红蛋白,还损害其它色素（二）混合固定液:由多个化学物质混合组成1.A-F液酒精-甲醛固定液固定兼脱水,固定后可直接入95%酒精脱水配制方法:95%以上浓度酒精90ml,40%甲醛10ml,混合而成2.Bouin液（1）优点:渗透力强,对组织固定均匀,收缩很小,不会使组织变硬变脆,适适用于睾丸活检等小组织固定（2）固定时间:小块组织只需数小时,较大脏器固定12～二十四小时（3）配制方法:苦味酸饱和水溶液75ml,40%甲醛水溶液25ml,冰醋酸5ml80%酒精150ml,40%甲醛60ml,冰醋酸15ml,加入结晶苦味酸1g（用前配制）3.Zenker液（1）优点:HE染色最好固定液,此液固定标本,胞核和胞质染色清楚（2）固定时间:12～二十四小时（3）缺点:配制该液试剂较昂贵,且需处理汞（4）配制方法:重铬酸钾2.5g,升汞5.0g,蒸馏水100ml将升汞、重铬酸钾和蒸馏水混于烧杯中,加热（40～50℃）溶解,冷却后过滤,贮存与棕色瓶中临用时取贮存液95ml,加入冰醋酸5ml4.Carnoy液（1）优点:穿透力强,能很好地固定胞质和染色质尤其适合固定外膜致密组织在固定组织同时,能溶解大部分脂肪用于糖原及尼氏小体固定对显示DNA和RNA效果很好（2）固定时间:小块组织固定1～2小时（3）配制方法:无水乙醇60ml,冰醋酸10ml,氯仿30ml。（4）缺点:氯仿有毒组织脱水、透明浸蜡和包埋:切片前处理过程,关键目是便于切薄片和长久保留组织块一、脱水用一些溶媒（脱水剂）置换组织内水分过程脱水剂必需能与水任意百分比混合常见脱水剂:有乙醇、丙酮及叔丁醇（2-甲基-2-丙醇）丙酮引发组织收缩作用强而较少应用为了降低组织急剧收缩,应使用从低浓度到高浓度递增次序进行,通常从70%浓度开始,经80%、95%直至无水乙醇二、透明组织块中水分被透明剂所替换,组织块变得透亮过程最常见透明剂为二甲苯,因其既能与酒精混合,又能溶解石蜡处理时间通常为30min左右其它透明剂:苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等三、浸蜡组织透明后在熔化石蜡内浸渍,让蜡液完全渗透入组织细胞内过程用于浸渍石蜡熔点为52℃～56℃浸蜡时间通常为3小时,需更换3次石蜡液浸透或透入:用其它浸透剂（火棉胶、碳蜡、明胶等）渗透组织内部过程四、包埋组织块经过浸蜡或浸透后,再用包埋剂包起来过程包埋后组织块含有一定硬度和柔韧性,有利于切薄片常见包埋剂:石蜡、火棉胶、碳蜡、明胶和塑料等,可依据不一样研究需要选择一、石蜡切片厚度:3～5μm漂片附贴（40℃恒温热水中完全展开）烘片:56～60℃,经30～60min石蜡切片注意事项用于DNA提取石蜡切片通常为5～10μm,用小镊子夹入微量离心管中,每管可装5～10片切片过程中应严格注意预防标本间交叉污染,以避免假阳性应避免刀痕、皱折和残缺二、冷冻切片适用范围:快速病理诊疗、酶组化染色、苏丹Ⅲ染色等厚度:6～8μm适应症确定病变性质确定切除肿瘤边缘是否有残余肿瘤组织以明确手术范围识别手术切除组织确定切除淋巴结内有没有转移肿瘤细胞不宜作冷冻切片诊疗情况骨、脂肪、钙化显著组织组织太少太小标本需依据核分裂计数判定良恶性软组织肿瘤疑为恶性淋巴瘤者其她风险及可能后果冷冻切片诊疗因为取材有限制片方法特殊染色质量差诊疗时间短等不足临床应用有一定风险性冷冻切片病理诊疗知情同意书难免有出现误诊可能性,病理医师将承受极大压力应该由临床医师、病理医师和患者共同来负担这种风险让患者知道自己可能面临多种结果,有权接收或拒绝该项检验常见病理染色技术及其应用一、苏木素-伊红染色HE染色,被称为常规染色能很好地显示组织结构和细胞形态保留时间长应用广泛1.染色步骤（略）2.结果显示:细胞核呈蓝色;细胞质、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不一样程度红色钙盐和多种微生物也可染成蓝色或紫蓝色3.注意事项切片脱蜡应根本依据染片多少和染液新鲜程度掌握染色时间长短分化处理要适度染色后酒精脱水应遵照从低浓度到高浓度,由快到慢,梯度脱水染色要求切片色泽鲜艳,明亮清楚二、常见特殊染色方法及其应用（一）结缔组织染色结缔组织含有三种纤维:胶原纤维、网状纤维和弹力纤维它们在HE染色时不易区分,特染可判别1.胶原纤维染色目:判定梭形细胞肿瘤起源:判定心肌瓣痕灶、早期肝硬化、肺纤维化以及其它纤维组织增加或降低性病变等常见方法:Masson三色染色法结果:胶原纤维呈蓝色,肌纤维和红细胞呈红色,细胞核为蓝褐色注意事项:Masson复合染色液经磷钨酸分化时须在显微镜下控制至肌纤维清楚为止苯胺蓝可用亮绿染料替换,此时胶原纤维染成绿色2.网状纤维染色目:显示网状纤维和基底膜用于判别①上皮性与非上皮性肿瘤②一些间叶组织肿瘤③判定原位癌与早期浸润癌④观察肝组织网状支架塌陷、破坏或增生等改变常见方法:Gomori银染色法结果:网状纤维呈黑色,胶原纤维呈红色,背景呈黄色注意事项:①配制氨性银溶液必需将器皿洗洁净,所用蒸馏水要纯②加氨水要适量,宜现用现配,以免银盐析出,影响染色结果③氧化液存放时间不能长,以免失去氧化作用④丽春红复染液通常须滴染,无水乙醇冲洗时要将切片倾斜,以防染液停留在切片上而造成组织中胶原纤维分布不均假象3.弹力纤维染色目:观察皮肤组织增殖改变老年性肺气肿纤维断裂、变性或萎缩高血压病时小动脉管壁弹力纤维异常增生AS动脉管壁弹力纤维崩解、断裂与缺失试验动物组织中血管壁损害和增生情况常见方法:醛品红弹力纤维染色法结果:弹性纤维呈深紫色,底色为不一样程度黄色注意事项:①醛品红染液要置冰箱内保留,用时恢复至室温②橙黄G液要淡染,不然会掩盖弹力纤维深紫色（二）糖类染色单糖和双糖多糖:淀粉、纤维素、糖原黏多糖:中性黏液物质和酸性黏液物质1.糖原染色目:①明确细胞内空泡性质②糖原贮积病诊疗③一些透明细胞肿瘤判别诊疗④低分化腺癌诊疗⑤早期浸润癌判定⑥肾小球肾炎分类诊疗常见方法:PAS染色法（过碘酸-Schiff）结果:糖原及其它PAS阳性反应物质呈红色,细胞核呈蓝色注意事项①组织固定要立刻,取材要小,以免糖原颗粒居于细胞一端②配制Schiff液重亚硫酸钠质量必需纯③Schiff液应置冰箱内保留,用时取出恢复室温后再进行染色④应设对照片（用唾液或1%淀粉酶消化后染色）⑤染色时间示温度而定,夏季短,冬季长2.粘液物质染色目:粘液性上皮肿瘤判别,证实肿瘤内是否有粘液常见方法:Alcianblue-PAS染色法结果:中性粘液物质呈红色,酸性粘液物质呈蓝色注意事项①Alcianblue染色时,玻片上不能涂白胶或火棉胶,以免背景着色②染PAS时采取滴染法,用过试剂不能再用3.组织中脂类显示法目:①判别细胞内空泡性质,对一些肿瘤诊疗有意义②显示胆固醇沉积、脂