微生物的培养技术及应用2004年

第1章第2节微生物的培养技术及应用第1课时微生物的基本培养技术目标010203通过对培养皿和培养基进行灭菌，了解消毒和灭菌的原理及方法。（科学思维）掌握通过配制培养基，了解配制培养基的基本步骤，以及培养基中各类营养物质的配比。（生命观念）通过对酵母菌进行纯培养，理解并掌握微生物接种、分离和培养的基本原理和过程。（科学探究）

向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。一般家庭自制酸奶可能会导致肠胃不适，主要原因是有杂菌混入。那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？这需要应用无菌技术和微生物的培养技术1.微生物的类群原核生物(细菌、蓝细菌等)原生生物(如草履虫、衣藻等)真菌(如酵母菌、霉菌等)酵母菌青霉菌大型真菌球菌蓝细菌放线菌草履虫衣藻病毒（无细胞结构）禽流感病毒SARS病毒你知道什么是微生物？哪些生物属于微生物吗？（难以用肉眼观察的微小生物的统称）真核生物

微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。３.实验室培养微生物关键:(1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件(2）确保其它微生物无法混入(3)并将需要的微生物分离出来培养基无菌技术纯化培养难以用肉眼观察到的微生物吃什么呢？该如何培养呢？【自主探究】请结合教材9-10页，思考以下问题：１.什么是培养基本？２.培养基的用途有哪些？３.培养基的种类有哪些？４.培养基的必备营养成分有哪些？５.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。培养基的配制无菌技术微生物的纯培养课堂练习1.定义：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2.作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。有无凝固剂琼脂液体培养基固体培养基微生物的分离、鉴定、活菌计数扩大培养、工业生产3.种类：微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。分析培养微生物的培养基的营养构成有哪些？组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、氮源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源、碳源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000mL水1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。（1）基本成分：碳源、氮源、水、无机盐1）碳源：无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-有机碳源：葡萄糖、牛肉膏等自养微生物异养微生物2）氮源：无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有机氮源：蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源3）无机盐：Ca、K、Mg为大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。4.培养基的营养构成:（2）特殊需求：满足微生物对pH、特殊营养物质、氧气的需求③培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；②培养霉菌时，需要将培养基调至酸性；④培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性；4.培养基的营养构成:无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？

旁栏思考无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。为什么培养基需要氮源?培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途（补充资料1)培养基的类型及用途不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基现学现用：

下列四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，正确的是()A.硝化细菌B.乳酸菌C.酵母菌D.衣藻硝化细菌乳酸菌酵母菌衣藻能源氧化NH3分解乳酸固定N2利用光能碳源CO2糖类糖类CO2氮源NH3N2N2NO3-代谢类型自养需氧型异养需氧型异样需氧型自养需氧型A1.无菌操作的对象是什么？2.获得纯净培养物的关键是什么？如何针对不同的作用对象选择合适的消毒/灭菌方法？请同学们自主学习教材P10-11页，小组合作思考讨论完成问题。

类型适用范围操作方法消毒灭菌1.无菌技术的对象：（1）实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。（2）培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。培养皿接种环培养基注意：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。为了避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。2.无菌技术的关键：获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。（1）消毒使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。1）概念：2）消毒的方法：①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。②巴氏消毒法：62-65℃下煮30min或80-90℃下煮30s-1min。

③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。

④紫外线消毒法：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台，在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果3.常用的消毒和灭菌方法：（2）灭菌

1）概念：指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。

芽孢

有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。

芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。孢子

细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。3.常用的消毒和灭菌方法：原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。对象：培养基、无菌水等注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。①湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121℃下维持15-30min高压蒸汽灭菌锅2）灭菌的方法：3.常用的消毒和灭菌方法：原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170℃下加热2-3h

③灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧效果：最彻底原理：使微生物燃烧对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位2）灭菌的方法：3.常用的消毒和灭菌方法：类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体（如牛奶）62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121℃,15～30min接种室、接种箱，超净工作台3.常用的消毒和灭菌方法：请回答下列问题：（1）实验器具用什么方法灭菌？（2）培养基用什么方法灭菌？（3）双手用什么方法消毒？（4）接种环用什么方法灭菌？（5）涂布器用什么方法灭菌？（6）为保证无杂菌，实验操作都要在哪里进行？（7）如何制备无菌水？高压蒸汽灭菌法灼烧灭菌法浸泡在75%酒精中，使用前灼烧超净工作台的酒精灯火焰旁用三角瓶装水，高压蒸汽灭菌法灭菌高压蒸汽灭菌法75%酒精擦拭现学现用：培养基的类型培养基的营养物质常用的消毒方法常用的灭菌方法培养基无菌技术煮沸消毒巴氏消毒化学药剂消毒紫外线消毒湿热灭菌干热灭菌灼烧灭菌按物理性质划分按功能划分微生物的基本培养技术按组成成分划分基本成分：碳源、氮源、水、无机盐特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等培养基的配制和无菌技术小结微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想看某种纯净的微生物,当我们掌握了培养基配制和无菌技术后，我们接下来该如何操作？（一）培养物、纯培养物、纯培养概念辨析：1.培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。2.纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。（二）纯培养的步骤：配置培养基灭菌倒平板接种和分离培养3.纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。探究•实验酵母菌的纯培养分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。1.菌落：定义：特征：大小、形状、颜色、光泽度、透明度、隆起程度等功能：不同菌落所具有的特征不同，菌落是鉴定菌种的重要依据。探究•实验酵母菌的纯培养2.纯培养：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。3.原理：微生物群分散或稀释单个细胞单个菌落繁殖探究•实验酵母菌的纯培养实验视频:酵母菌的纯培养探究•实验酵母菌的纯培养制备培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价1.配制培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml.2.灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min.将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h.包器材（有时需调pH）探究•实验酵母菌的纯培养3.倒平板——待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。制备培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价1.拔出锥形瓶的棉塞2.将瓶口迅速通过火焰3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入，立即盖上皿盖。4.等待培养皿冷却后，将培养皿倒过来放置。倒平板注意事项：①温度：50℃左右②操作：在酒精灯火焰附近③冷凝后平板倒置通过灼烧灭菌，防止瓶口微生物污染培养基探究•实验酵母菌的纯培养倒平板注意事项：(1)需要冷却到50℃左右时，才能倒平板，为什么？用什么办法来判断温度？用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。(2)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？将平板倒置，既可以避免培养基中的水分过快蒸发又可防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。过高：烫手；过低：琼脂会凝固(3)培养基的制作是否合格？如果未接种的培养基在恒温箱中保温1-2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。制培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价3.倒平板探究•实验酵母菌的纯培养制培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。单个细胞微生物群单个菌落连续划线分散或稀释生长繁殖平板划线”实验操作探究•实验酵母菌的纯培养制备培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价①③②④⑤⑥⑥⑤①②④请同学们阅读教材P13平板划线法,将下图排序答案：1.平板划线法③⑦1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。⑦探究•实验酵母菌的纯培养制备培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.②划线首尾不能相接③每次划线前接种环进行灭菌④划线后,培养皿倒置培养注意事项:1.平板划线法12345思考：若完成图示操作，共做了五次划线，接种环灼烧灭菌了几次？制培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价探究•实验酵母菌的纯培养1.平板划线法为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上原有微生物制培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价1.平板划线法探究•实验酵母菌的纯培养在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？以免接种环温度太高，杀死菌种。在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。制培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价探究•实验酵母菌的纯培养

完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染探究•实验酵母菌的纯培养制培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。探究•实验酵母菌的纯培养制培养基接种酵母菌分离酵母菌培养酵母菌分析与评价2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。3.你是如何记录实验结果的？可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等。酵母菌的纯培养2.接种和分离酵母菌1.制备培养基3.培养酵母菌①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）②灭菌③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）用接种环在固体培养基上用平板划线法接种平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养课堂小结

所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质,食用后可能会危害人体健康。因此,“吃水果‘酵素’可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。评估“水果酵素”的功效是否真实？思维训练1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。

（）（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（）（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。