细菌感染的实验室诊断

第三章

细菌感染的病原学诊断第一节标本的采集和处理原那么一、标本采集的一般原那么1.早期采集2.无菌采集无菌部位:严格无菌操作有正常菌群部位：明确目的菌；选择适宜的选择培养基3.采用不同方法采集需氧菌或兼性厌氧菌厌氧菌：穿刺法采集4.采集适量标本和适当标本采集有明显病变的标本根据病程采集不同的临床标本5.平安采集二、标本的处理1.及时送检2.运送与保存1〕根据待检菌特点对标本进行冷藏、保温或保持厌氧状态2〕注意平安防护第二节细菌形态学检查显微镜种类1.普通光学显微镜〔lightmicroscope〕光源：可见光2.暗视野显微镜〔darkfieldmicroscope〕暗背景，菌体发光用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察3.相差显微镜检查不染色活细菌的形态及某些内部结构4.荧光显微镜光源：100W~200W的高压汞灯5.电子显微镜光源：电子流透射电镜：观察细菌内部超微结构扫描电镜：对细菌外表结构及附件观察一、不染色标本的检查常用方法压滴法悬滴法毛吸管法用于检查厌氧菌动力用途动力试验——检查细菌有无动力制动试验——鉴定血清型三、染色标本的检查〔一〕常用染料色基：决定染料的颜色助色基：决定染料的酸碱性1.碱性染料电离后色基带正电荷细菌染色常用，如美蓝、结晶紫、碱性复红等2.酸性染料用于细胞浆染色，如伊红、酸性复红、刚果红3.复合染料〔中性染料〕碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染料、姬姆萨染料等4.单纯染料如苏丹染料，溶于脂肪溶剂，不溶于水，化学亲和力低〔二〕常用的细菌染色法单染色法只用一种染料，如吕氏美蓝复染色法用两种或两种以上不同颜色的染料细菌染色的一般程序1.涂片2.枯燥：自然枯燥为好3.固定4.初染5.媒染媒染剂6.脱色脱色剂7.复染1.革兰染色法〔Gramstain〕〔1〕原理1〕细胞壁学说：两种细菌细胞壁通透性不同2〕等电点学说3〕化学学说：两种细菌含有RNA镁盐不同〔2〕方法：制片→结晶紫初染→碘液媒染→酒精脱色→复红复染→结果革兰阳性菌﹙G＋﹚：紫色革兰阴性菌﹙G－﹚：红色

2.抗酸染色法细菌着色后不被盐酸酒精脱色的染色方法染料：石炭酸复红、盐酸酒精、美蓝方法初染：5%石炭酸复红加热染色5min脱色：3%盐酸酒精复染：吕氏美蓝肺炎链球菌荚膜染色墨汁负染法芽胞染色第三节细菌别离培养和鉴定一、培养基的种类和选择培养基〔culturemedium〕由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。〔一〕培养基的组成成分1.营养物质碳源、氮源、无机盐、水、生长因子〔1〕蛋白胨提供氮源植物胨:大豆动物胨：牛肉、动物组织等〔2〕肉浸液碳源、氮源〔3〕牛肉膏氮源〔4〕糖〔醇〕类碳源和能源〔5〕血液提供特殊生长因子、观察溶血〔6〕无机盐类常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等微量元素：Co、Zn、Mn、Cu、Mu等〔7〕鸡蛋与动物血清用于某些特殊培养基〔8〕生长因子维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等2.凝固物质即赋形剂〔1〕琼脂〔2〕明胶动物胶原组织熬制而成3.抑制剂和指示剂〔1〕抑制剂：胆盐、煌绿、染料、抗生素等选择培养基：参加一定种类的抑制剂，以抑制杂菌生长或减少生长，有利于检出菌生长的培养基。〔2〕指示剂：酚红、中性红、中国蓝等鉴别培养基：参加特定底物和指示剂〔二〕培养基的种类1.按培养基的物理性状〔1〕液体培养基：增菌〔2〕固体培养基：纯化，增菌〔3〕半固体培养基：动力检测，保种

液体培养基固体斜面培养基半固体培养基2.按营养成分和用途分类〔1〕根底培养基：只有根本营养成分〔2〕营养培养基：加有血液、血清等〔3〕鉴别培养基：含有特定底物和指示剂〔4〕选择培养基：含有抑制剂〔5〕特殊培养基：厌氧、细菌L型〔三〕培养基的选择1.血平板最常用2.巧克力血平板奈瑟菌属、流感嗜血杆菌3.肠道选择培养基别离肠道细菌常用中国蓝、EMB、MAC、SS4.碱性琼脂或TCBS别离霍乱弧菌5.血液增菌培养基血液、骨髓增菌用6.营养肉汤增菌用〔四〕培养基的制备1.常用各种器具灭菌前的准备〔1〕培养皿：用纸包裹〔2〕试管：加塞后用纸包好〔3〕吸管和毛细管〔4〕烧瓶2.培养基制备的一般程序〔1〕调配根据培养基组成，准确称取各组分，先加需要蒸馏水的一局部，再加培养基干粉，最后补足水量。〔2〕溶化液体培养基不需加热〔3〕调整pH值一般7.2~7.6〔4〕过滤澄清〔一般可以省略〕液体培养基：滤纸固体培养基：纱布〔5〕分装平板：灭菌后冷却至50℃~60℃时倾倒90mm25~30ml〔4mm〕：药敏用90mm13~15ml(3mm)：培养用琼脂斜面：分装量为试管的1/4~1/3，灭菌后趁热制成斜面，斜面长度2/3高层、半固体、液体：分装量为试管长度1/4~2/3〔6〕灭菌高压蒸汽灭菌无糖：103.4kPa121.3℃15~30min含糖：68.4kPa115℃15min流动蒸汽灭菌法血清、牛乳、鸡蛋间歇蒸汽灭菌法〔7〕鉴定无菌试验：将制好的培养基在35℃孵育过夜，判定是否灭菌合格。效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的生长状况，判断培养基是否符合要求。〔8〕保存4℃冰箱保存，一周左右本卷须知1.器皿中性硬质玻璃器皿2.化学药品化学纯以上3.准确称量，正确溶解4.准确测定培养基酸碱度5.保持澄清6.灭菌时间不宜过长，不宜反复灭菌二、别离培养3.移种或接种的根本步骤4.常用的接种方法〔1〕平板划线法分区划线法用于杂菌量较多的标本连续划线法用于杂菌不多的标本〔2〕琼脂斜面接种法—纯培养〔3〕穿刺法—观察细菌动力〔4〕液体培养基接种法—增菌〔5〕倾注平板法—计数细菌数量〔6〕涂布法—纸片法药敏试验〔二〕细菌的培养方法1.需氧培养法普通培养2.二氧化碳培养〔1〕二氧化碳培养箱〔2〕烛缸法〔3〕化学法3.厌氧培养〔三〕细菌的生长现象1.固体培养基上的生长现象菌落：单个细菌在培养基上分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团。CFU：菌落形成单位，活菌计数用细菌菌落的描述大小、形状、突起或扁平、边缘、颜色、外表、透明度〔1〕光滑型菌落〔S型菌落〕外表光滑、湿润、边缘整齐〔2〕粗糙型菌落〔R型菌落〕外表粗糙、枯燥、边缘不齐〔3〕粘液型菌落〔M型菌落〕菌落粘稠、有光泽、似水珠样卷发样菌落粗糙型菌落〔L-J〕粘液型菌落2.液体培养基中的生长情况外表生长均匀混浊生长沉淀生长三、细菌生化反响鉴定〔一〕碳水化合物的代谢试验1.糖〔醇、苷〕类发酵试验原理各种细菌酶系不同，分解糖〔醇、苷〕的能力各异，产物也不同。培养基单糖、双糖、三糖、多糖应用肠道杆菌科细菌的鉴定

SugarFermentation

2.葡萄糖氧化/发酵试验〔O/F〕原理氧化型专性需氧菌发酵型产碱型不分解葡萄糖培养基Hugh-Leifson二氏培养基结果氧化管发酵管氧化型变黄不变发酵型变黄变黄产碱型不变不变〔阴性〕应用

鉴别肠杆菌科细菌与非发酵菌3.β-半乳糖苷酶〔ONPG〕试验原理ONPG无色，经β-半乳糖苷酶水解后生成黄色的邻硝基酚方法〔1〕在含ONPG的培养基中接种纯种细菌〔2〕制成菌悬液，参加甲苯，再加ONPG试剂结果阳性：变黄〔20~30min〕应用缓慢发酵乳糖菌株的快速鉴定4.七叶苷水解试验原理葡萄糖七叶苷七叶素+Fe2+黑色化合物培养基七叶苷、胆汁七叶苷培养基结果阳性：培养基变黑用途鉴别肠球菌、G-杆菌及厌氧菌5.甲基红〔methylredMR〕试验原理葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇甲基红-葡萄糖→丙酮酸→各种酸甲基红+培养基葡萄糖蛋白胨水结果阳性：红色阴性：黄色应用鉴别肠杆菌科细菌6.VP〔Voges-Proskauer〕试验原理葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→二乙酰＋肌酸＋α萘酚→红色化合物培养基葡萄糖蛋白胨水结果阳性：红色应用鉴别肠杆菌科细菌〔二〕蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验原理：某些细菌可产生明胶酶，分解明胶，使其失去凝固能力。方法：将待检物接种于明胶培养基22℃培养7天结果：培养基呈液化状态为阳性应用：肠杆菌科细菌鉴别

3.硫化氢试验原理含硫氨基酸→H2S+硫酸亚铁→FeS黑色醋酸铅→PbS黑色培养基醋酸铅培养基结果阳性：黑色沉淀用途肠杆菌科菌属间的鉴定4.尿素分解试验原理尿素NH3+CO2+H2O(NH4)2CO3培养基尿素肉汤或尿素琼脂培养基结果阳性：红色用途肠杆菌科中变形杆菌的鉴定5.苯丙氨酸脱氨酶试验原理苯丙氨酸苯丙酮酸+10%氯化铁绿色化合物培养基苯丙氨酸琼脂培养基

结果阳性：绿色用途肠杆菌科中变形杆菌的鉴定6.氨基酸脱羧酶试验〔三〕碳源和氮源利用试验1.枸橼酸盐利用试验原理铵盐碳酸钠+氨培养基枸橼酸盐培养基结果阳性：蓝色阴性：绿色2.丙二酸盐利用试验利用枸橼酸盐生长+不能利用-

IMViC试验大肠埃希菌++--产气杆菌--++〔四〕各种酶类试验1.氧化酶试验原理方法菌落法滤纸法试剂纸片法结果深紫色为阳性2.过氧化氢酶试验3.硝酸盐复原试验4.脂酶试验5.卵磷脂酶试验6.DNA酶试验7.凝固酶试验8.CAMP试验9.胆汁溶菌试验〔五〕抑菌试验1.O/129试验用于弧菌科的属间鉴别2.杆菌肽试验用于A群链球菌与其他链球菌间的鉴别3.奥普托欣试验用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别第四节细菌的非培养检测方法一、免疫学检测利用抗原、抗体特异性结合的原理，用已知抗原检测未知抗体，或用抗体检测未知抗原。反向间接血凝试验1.直接法：荧光素标记抗体2.间接法：荧光素标记二抗〔抗抗体〕3.免疫荧光菌球法酶联免疫吸附试验-ELISA1.双抗体夹心法2.竞争法阳性-无色〔二〕抗体检测用的细菌或其特异性抗原检测病人血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，辅助诊断某些传染病。二、分子生物学检测三、细菌毒素的检测〔一〕内毒素1.内毒素的致热作用〔体内实验〕原理：内毒素产生于G-菌，菌体死亡后释放，作用于体温调节中枢，引起发热。方法：〔1〕将家兔分成两组，每组4只，测量基础体温并记录。〔2〕用无菌注射器抽取待检物注入一组家兔耳静脉，另一组注射等量生理盐水。〔3〕观察动物反响，并间隔30min测量两组家兔体温。结果：阳性试验组体温升高对照组体温正常应用：无菌的生物制品2.鲎试验〔体外实验〕原理：鲎血液中含有一种变形细胞，此细胞裂解物可与微量内毒素起凝胶反响，即细胞裂解物中的一种酶被激活，使细胞裂解物中的蛋白质形成凝胶。鲎试剂：鲎变形细胞裂解物方法〔1〕翻开3支鲎试剂安瓶，各加0.1ml无菌蒸馏水使之溶解，同时编号。〔2〕向3支安瓶中分别加待测物、标准内毒素、无热原生理盐水各0.1ml。〔3〕轻轻摇匀，垂直放37℃水浴，15~30min后观察结果。鲎试验结果-不形成凝胶+形成凝胶，但不牢固++形成牢固凝胶，倒持安瓶凝胶不动。应用鲎试验〔二〕外毒素1.体内毒力试验原理：细菌外毒素对机体具有强烈毒性作用，但可被相应抗毒素中和，中和后，实验动物不产生中毒病症。如：破伤风外毒素的毒性作用和抗毒素保护作用。2.体外毒力试验抗原抗体反响四、动物实验〔一〕实验动物的分类1.遗传学控制方法分类〔1〕近交系动物纯系动物〔2〕突变种纯系动物〔3〕杂种动物2.微生物学控制方法分类〔1〕无菌动物〔GF〕〔2〕悉生动物〔GB〕〔3〕无特殊病原体动物〔SPF〕〔4〕清洁动物或最低限度疾病动物〔5〕普通动物〔二〕实验动物的选择1.选择敏感动物2.选择不同种类和品系动物3.