基因工程原理及实验技术(共39张)

基因工程原理及实验技术第一页，共39页。第一章基因工程的概论第一节基因工程的概念

一、基因工程的基本概念

狭义基因工程

广义基因工程第二页，共39页。狭义基因工程

狭义的基因工程(geneengineering):

从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另—种生物体(受体)内．使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受休、载体称为基因工程的三大要素。第三页，共39页。狭义基因工程

狭义的基因工程:就是重组DNA技术（recombinantDNAtechniques）1）重组DNA技术

（recombinantDNAtechniques)2）分子克隆（molecularcloning)3）基因克隆（genecloning)4）遗传操作(geneticmanipulation）5）遗传工程(geneticengineering)6）基因工程(geneengineering)第四页，共39页。广义基因工程广义的基因工程：是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆、表达的设计与构建(即狭义的基因工程)；下游技术则涉及含有重组外源基因的生物细胞(基因工程菌或细胞)的大规模培养以及外源基因的表达、产物的分离、纯化过程。因此，广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。

第五页，共39页。第六页，共39页。广义的基因工程是一个高度统一的整体。上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想。而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现与保证。这是基因工程产业化的基本原则。第七页，共39页。狭义的基因工程

重组DNA技术

广义的基因工程

重组DNA技术细胞工程染色体工程细胞器工程第八页，共39页。二、基因工程的基本过程

基因工程:两大部分组成

基因工程的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建和基因产物的生产两大部分组成

工程菌(细胞)的设计构建:实验室里进行，其单元操作过程如下:(1)从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称“切”)；第九页，共39页。

(2)用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上形成DNA重组分子(简称“接”)；

(3)借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中(简称“转”)；(4)短时间培养转化细胞、以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称“增”)；(5)筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞(简称“检”)；基因工程的上游操作过程；可简化为：切、接、转、增、检。

第十页，共39页。三．基因工程的基本原理

基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达为目的．其基本原理可从以下四个方面考虑。（1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量．借此提高其宏观表达水平。这里涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。第十一页，共39页。

(2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接．通过强化外源基因的转录提高其表达水平。

(3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件。强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。

上述(2)和(3)两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理。第十二页，共39页。(4)基因工程菌(细胞)是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌(细胞)大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程的基本理论体系。因此．分子遗传学、分子生物学以及生物化学是基因工程原理的三大基石。第十三页，共39页。.四、生物工程等概念生物工程：直接或间接利用生物体的机能生产物质的技术。包括发酵技术、基因重组、细胞融合、细胞大量培养、生物反应器等技术。生物技术：是在细胞水平上，特别是在分子水平上对生物体遗传性实现巨大的接近定向改造的一套内容繁多和复杂的技术。包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等。第十四页，共39页。现代科技革命高新技术生物技术基因工程基因克隆第十五页，共39页。而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现与保证。1970年，美国生化學家Simith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离提纯了限制性核酸内切酶HindⅡ（1978年诺贝尔生理医学奖获得者)遗传信息的传递方式（中心法则）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理1977年日本的Itakura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。（1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量．借此提高其宏观表达水平。遗传信息的传递方式（中心法则）高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状；导致第四次工业大革命1个月后在（自然）杂志上又发表了遗传物质的复制机理。基因工程的发展历史概括为三个阶段医学：抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心脏血管药物、生长因子诊断剂

2.第三十三页，共39页。第二十九页，共39页。基因工程是一项新兴的工程技术，它的诞生需要理论和技术上的支持DNA分子的核苷酸序列分析技术，琼脂糖凝胶电泳和Southern杂交技术等技术的展。第二节

基因工程的发展历史基因工程的发展历史概括为三个阶段

基因工程的诞生

基因工程的成熟基因工程的腾飞第十六页，共39页。一、基因工程的诞生

基因工程是一项新兴的工程技术，它的诞生需要理论和技术上的支持理论上的三大发现技术上的三大发明第十七页，共39页。证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理遗传信息的传递方式（中心法则）1.理论上的三大发现第十八页，共39页。

证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）：1944年首先用体外的转化实验证明基因的化学本质就是DNA分子的是加拿大生物化学家艾弗里O.T.Avery（1877-1955）。他和他的合作者C．M．MacLeod及M．McCarty在纽约进行细菌转化的研究。

1)遗传物质是DNA第十九页，共39页。

体外的转化实验证明基因就是DNA分子第二十页，共39页。2).DNA的双螺旋结构和半保留复制机理

DNA双螺旋结构的发现Watson（沃森）andCrick（克里克）（1953）

美国遗传学家Watson(J.Watson)和英国生物学家克里克(F.Crick)

1953年4月25日DNA的双螺旋结构假说（不到1000字的短文）《核酸的分子结构——脱氧核糖核酸的一个结构模型》在（自然）杂志上发表。1个月后在（自然）杂志上又发表了遗传物质的复制机理。1962年与M.H.F.Wilkins共获诺贝尔生理学奖。DNA半保留复制机理的证明－Meselson-Stahl实验(1958)DNA复制模式的破解M.Meselson(MatthewMeselson,西尔逊)andF.W.Stahl(FranklinStahl,斯塔尔)(1958)1958年来西尔逊（Meselson）和斯塔尔（Stahl）首次在分子水平上成功地证明了DNA的半保守复制（semiconservativereplication）利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制(15N)

第二十一页，共39页。DNA半保留复制图第二十二页，共39页。3）遗传信息的传递方式（中心法则）

中心法则的确立F.Crick(1958)中心法则的确立F.Crick(1958)中心法则的确立F.Crick(1958）1958年克里克确立的中心法则(1971年修改),最早提出遗传密码这一名词的是量子力学奠基人之一，奥地利物理学家施勒丁格(E．Schrodinger，1944)。第一个提出遗传密码具体设想的是美国物理学家G.Gamov，他通过推算提出了三联体密码子的概念，并且进一步推论一种氨基酸可能不止有一个密码子。第一个用实验破译密码子的是马太(Matthaei)和尼伦伯格(Nirenberg)，1966M.NirenbergandH.Khorana（1968年诺贝尔生理医学奖获得者）建立了完整的遗传密码表第二十三页，共39页。DNA技术分子体外切割与连接技术限制性内切酶(1970)和DNA连接酶(1967)发现，标志着DNA重组时代的开始基因工程载体技术

1970载体（vector）的使用成功1970年，逆转录酶的发现使真核基因的制备成为可能。2技术上的三大发明第二十四页，共39页。DNA技术分子体外切割与连接技术

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—限制性内切酶和DNA连接酶的发现限制性核酸内切酶HindⅡ1970年，美国生化學家Simith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离提纯了限制性核酸内切酶

HindⅡ（1978年诺贝尔生理医学奖获得者)EcoR1限制性核酸内切酶(1972年Bover实验室发现）G↙AATTCDNA连接酶的发现：1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。1970年，在美国Khorana实验室发现了一种高效连接活性的DNA连接酶—T4DNA连接酶

第二十五页，共39页。

1970美国DulleccoTemin和Baltimore（1975年诺贝尔生理医学奖获得者）在肿瘤病毒中存在反转录酶打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。

DNA分子序列分析及相关技术的发展也推动了基因工程的发展DNA分子的核苷酸序列分析技术，琼脂糖凝胶电泳和Southern杂交技术等技术的展。基因工程载体技术1970载体（vector）的使用成功.1970年λ噬菌体导入大肠杆菌细胞内（转化）1970年，逆转录的发现.第二十六页，共39页。

1973年，美国斯坦福大学Boyer和Cohen等获得了抗四环素和抗新霉素（卡那霉素）的重组菌落，标志着基因工程的诞生。1973年建立的基因工程的基本模式为标志的。他们将大肠杆菌体内的两个不同的质粒提取出来，拼接成一个杂合的质粒。当杂合质粒被导入大肠杆菌后，它能在大肠杆菌内复制并表达双亲质粒的遗传信息。这是基因工程的第一个成功的克隆转化实验。

Tetracycline

pSC101EcoRIDNALigaseKanamycin

R6-5Kanr

andTetr基因工程的诞生标志第二十七页，共39页。基因工程的成熟

1977年日本的Itakura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。几个月后．美国的Ullvich克隆并表达了人的胰岛素基因。1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序幕。

第二十八页，共39页。表1-1主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品时间国家用途上市时间国家人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本巨人症人胰岛素1978美国糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH）1979美国侏儒症1985美国人α-干扰素（IFN）1980美国病毒1985欧洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美国乙肝1986欧洲人白细胞介素1984美国肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素（EPO）日本贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症1987美国第二十九页，共39页。三、基因工程的腾飞：1.1982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠；

2.1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌Neor基因）

3.1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID）

4.1990年，美国倡导，人类基因组计划，15年时间30亿USD；2000年6月26日各国科学家向全世界宣布“人类基因组计划”工作草图绘制成功，“基因”和“基因组研究”更是成为人们谈论的焦点问题。2003人类基因组侧序完成。5.1997年，英国，克隆多利绵羊第三十页，共39页。第三十一页，共39页。三、基因工程的腾飞：第三十二页，共39页。第三十三页，共39页。第三十四页，共39页。四.基因工程的意义

基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因