DB12T 199-2004 以大豆为原料的酱油等发酵产品中转基因成分的定性检测方法

2004-07-28发布2004-07-28实施天津市质量技术监督局发布I用了欧盟推荐的检测方法，项目编号为EU-ProjectSMT4-CT96-2072,方法编号为Brodmann,P.97c和Brodmann,P.97d,检本标准由未津市农产品质量监督检验测试中心提出。本标准起草单位：天津市农产品质量监督检验测试中心、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：金红、赵昕、王永、程奕、郑贵忠。1本标准规定了酱油等液态发酵制品和豆腐乳等固态发酵制品中转基因成分的定性聚合酶链式反应(简称为PCR)检测方法。2规范性引用文件修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T1194植物及其产品转基因成分检测的抽样和制样方法SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法下列术语、定义和缩略语适用于本标准。物种本身不具有的、而是来源于其他物种的功能基因序列。模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTPs)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是否3.4.1GMO:geneticallym3.4.2PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式反应。3.4.3DNA:deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸。3.4.4dNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核甘三磷酸。3.4.5Lectin:植物凝集素基因，为大豆本身含有的内源基因。3.4.6CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus,花椰菜花叶病毒35S启动子。3.4.7NOS:TerminatorofnopalinesynthasegenefromAagrobacteriumtumefaciens,来源于农杆菌的胭23.4.9GTS403-2:美国Monsanto公司的基因有CaMV3SS启动子，NOS终止子和CP4-EPSPS基因等。4防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。5抽样和制样按照SN/T1194中规定的方法进行。6测定方法液态和固态大豆发酵制品经过提取DNA后，根据加工用的转基因大豆原料所插入的外源基因设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)技术，特异性扩增外源基因的DNA片断，根据PCR扩增结果，判6.2.1电子天平(感量分别为0.01g和0.0001g)。6.2.3低温超速离心机，台式冷冻离心机。6.2.4研钵及粉碎装置。6.2,5普通冰箱，超低温冰箱。6.2.9微量移液器(0.1~2.5HL,1~10HL,10~100HL,100~1000A)。6.2.12凝胶成像分析系统或紫外透射分析仪。6.2.15液氮罐6.3试剂和材料实验用水为I级。6.3.2三羟甲基氨基甲烷(Tris)。6.3.3二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na:2H₂O)。6.3.4聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。6.3.5三氯甲烷。6.3.8三氯甲烷：异戊醇=24:1(体积比)。36.3.970%乙醇和无水乙醇。g,PVP20g,用浓盐酸调pH值至8.0。6.3.12氯化钠溶液(1.2mol/L):1000ml水中溶解70g。6.3.13乙酸钠溶液(3mol/L):800408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2,加水定容至1L。6.3.14Tris-HCl溶液(0.1mol/L,pH8.0):800ml水中溶解12.114gTris,冷却至室温，用浓盐酸调pH值至8.0,定容至1L。6.3.17dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dUTP)溶液：各2.5mmol/L。6.3.18Taq酶：2U/HL。6.3.25GTS40-3-2转基因大豆阳6.3.27滤芯吸头(10HL,20HL,100HL,200HL,1000HL)。6.3.28PCR反应管(200HL)。6.3.30引物：转基因大豆的内源基因和外源基因检测时所用的引物序列见表1。表1转基因大豆的内源基因和外源基因的引物序列检测基因基因性质内源基因外源基因外源基因外源基因品系鉴定取酱油等液态发酵样品30mL,加入60mL无水乙醇(6.3.9)混匀，置超低温冰箱(-20℃)放置10min后，取出在4C10000r/min离心10min,弃上清，在沉淀中加入30mL0.1MTris-HCI溶液 (6.3.14),用力摇匀，全部转移至100mL烧杯中，于磁力搅拌器上搅拌2小时，室温12000r/min离心10min,弃上清，留沉淀用于DNA提取。取固态发酵样品5g,置预冷研钵中，加液氮(6.3.29)研磨成粉末，转入50mL离心管中，用于6.4.1.2CTAB法提取DNA取经预处理的样品加入10mL经65℃预热的CTAB提取缓冲液(6.3.10),摇匀。65℃水浴1小时，期间每隔10min轻轻颠倒混匀一次，取出静置冷却至室温，12000r/min离心12min,取上清，加入等体积的三氯甲烷+异戊醇(6.3.8)缓慢颠倒摇匀5min,10000r/min离心10min,取上清，加入等体积的三氯甲烷+异戊醇(6.3.8)重复抽提一次，取上清，加入2倍体积的CTAB沉淀液(6.3.11),摇匀，室温静置1小时，12000r/min离心10min,弃上清，沉淀加入1.2mol/LNaCl溶液(6.3.12)1mL溶解沉淀，室温静置5min,加入等体积三氯甲烷+异戊醇(6.3.8)颠倒摇匀1min,12000r/min离心10min,取上清，加入10%的3mol/L乙酸钠(6.3.13)和等体积的冷异丙醇(6.3.7),缓慢混匀，4℃静置过夜，14000r/min离心15min,弃上清，加入400HL70%冷乙醇(6.3.9)洗涤沉淀，除去残留的乙醇，待沉淀干燥后，加入30LL灭菌的去离子水溶解DNA(6.3.19)沉淀，-20℃保存备用。6.4.2样品中DNA质量的鉴定采用内源基因扩增法鉴定所提取的样品DNA的质量。通过PCR技术，扩增大豆内源基因。6.4.3.1PCR反应体系检测以大車为原料的发酵制品中内源基因和外源基因采用的PCR检测体系见表2。反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。每个反应体系应该设置两个平行管。10×PCR反氯化镁(25(各正向引物(反向引物(Taq酶(2U模板(样品的D水6.4.3.2反应体系对照的设置进行PCR检测时反应体系必须设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：用转基因大豆材料中提取的DNA作为PCR反应体系的DNA模板；阴性对照：用非转基因大豆材料中提取的DNA为6.4.3.3样品中内源基因和外源基因的检测以大豆为原料的样品的内源基因和外源基因的PCR检测的参考反应条件见表3。反应条件需根据因扩增最后延伸5S9用1×TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶(凝胶融化后晾至60℃左右时加入溴化乙锭，含量为合适的DNA分子量标记物，选择合适的电压(3V/cm~5V/cm)进行电泳，电泳时间为40min~606.4.3.5凝胶成像分析(照相)电泳结束店，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成增出的目的条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。对于大豆特异性内源基因Lectin片段的检测，如果阴性对照、待测样品和阳性对照的PCR产物都出现118bp的条带，则表明提取的待测样品DNA符合PCR反应的要求，能用于外源基因的检测；否则不能用于检测外源基因，应该重新提取待测样品DNA,直到能扩增出118bp的条带，防止检测中产对待测样品DNA提取液进行外源基因的PCR检测，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带，则可判断待测样品中含有外源基因。对酱油等发酵制品中转基因成分的检测，可参考表1的内容，先筛选检测CaMV35S、NOS基因，若筛选检测结果阳性，则需进一步鉴定检测外源目的基因片段CP4EPSPS和P-35S/CTP,如果外源基因CP4EPSPS和P-35S/CTP的扩增结果同时也