DB35∕T 1872-2019 鸭3型腺病毒病诊断技术

DB35Diagnostictechniqueforduckadenovirus3infect福建省市场监督管理局发布I 1 1 1 1 1 3 4 6 7本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研1鸭3型腺病毒病诊断技术本标准适用于鸭3型腺病毒病的临床诊断、实验室诊断和DAdV-3：鸭3型腺病毒（DuckAdenovirus3）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReactPBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferTris：三羟甲基氨基甲烷（TrihydroxymethylAmin腺病毒科（Adenoviridae）下设5个属，分别为富AT腺病毒属（Atadenovirus）、禽腺病毒属（Aviadenovirus）、鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）、哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）和唾液4.1剖检病变4.2初步诊断5.1主要仪器设备2）；e)酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）；）；上游引物DAdV-3F：5,-ACACTAGACAACGGAGGCCT-3,。下游引物DAdV-3R：5,-AATCTTGATACGTAATCATACACA-3,。），），3可采用市售商品化的等效核酸DNA提取试剂盒，按照说明书完成核5.5对照5.6.2也可采用市售商品化的等效PCR预混液检测试剂盒，并按照市售商品PCR扩增反应结束后，PCR反应管在电泳鉴定前可置于2℃~8℃冰箱保存。分别取5μLPCR扩增（配置方法按照附录A中A.6的规定）板的加样孔中，加上DNA分子量标准5μL，以5V/cm的电压进行电泳，30min后在紫外凝胶成像系统观察结果。当阳性对照出现约548bp的特异性条带（参见附录B图B.1中1号泳道）、阴性对照见附录B图B.1中2号泳道空白对照无扩增条带（参见附录B图B.1中3号泳道当待检样品出现约548bp条带（参见附录B图B.1中4号泳道可判定为阳性；当待检样品无性扩增条带（参见附录B图B.1中5号泳道）判为阴性。必要时，将目的条带进行胶回收后克隆测序，待测样品的测序结果和参考序列（参见附录C）进行核苷酸同源性4试剂的配制A.110%十二烷基硫酸钠将10g十二烷基硫酸钠溶于80mL灭菌双蒸水中，调节溶液的pHA.2蛋白酶K（10mg/mL）A.375%乙醇取无水乙醇750mL加入灭菌双蒸水250mL，定容至1000mL，-Na2HPO4·12H2O2.9gKH2PO4将上述试剂溶于800mL灭菌双蒸水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高压灭菌30min，4℃保置微波炉中加热至完全融化，待冷至50℃~60℃时，加溴化乙锭溶液（配制方法按照A.8的规5A.71×TAE电泳缓冲液A.8溴化乙锭溶液A.950×TAE电泳缓冲液6）；7 ACACTAGACAACGGAGGCCTCGACCTCAAGGTGGACCCAGGAAGCCTGGCCGTCACTGACAATACCCTACACCTCACAAGCTCATACTCAACCTATGTCTTTACGAGTGGATCTGACACACTTCAGAAGACACAAGCCCAAGTGTGCTGCGGAGCAGGGTCTGTTACGTTTCCGTGCGCATACTATGCCAAGATCGTATGCTCAAACAATGTGTCTTCAGGATATATAACACTGAAGGTGAGCGCTGAGGATGCATCACATGCTGTAGATCAACGCTTCGCGACTATTCAACCAGTATTCACATTCTGGTTATGTCGAGACATAGGTAATGAAAACACCGTCAATTTTTCCCACTGTACCAACAACAGTTATAAGCCAGAGGAAACCGCAGTCGTTAAGGCATGCATCACACCAGCATACAAAAATTTTGATGTCAGCAATGTT