细胞工程自选实验

细胞工程自选实验一、实验目的本次自选实验旨在通过实践操作，深入了解细胞工程的基本原理和技术方法，掌握细胞培养、细胞融合、单克隆抗体制备等关键技术，培养学生的实验技能和科学思维能力，为进一步学习和研究细胞工程相关领域奠定基础。

二、实验材料与仪器1.实验材料动物细胞：小鼠骨髓瘤细胞、小鼠脾细胞培养基：RPMI1640培养基、小牛血清、双抗（青霉素、链霉素）试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、HT培养基、碱性磷酸酶底物等其他材料：96孔细胞培养板、细胞培养瓶、移液枪、离心管、培养箱等2.实验仪器细胞培养箱：用于维持细胞生长所需的适宜温度、湿度和气体环境超净工作台：提供无菌操作环境倒置显微镜：用于观察细胞形态和生长状况离心机：用于细胞离心酶标仪：用于检测细胞培养上清中的相关指标

三、实验方法与步骤

细胞培养1.培养基的配制在无菌条件下，将RPMI1640培养基、小牛血清、双抗按照一定比例混合，配制成完全培养基。调节培养基的pH值至7.27.4。2.细胞复苏从液氮罐中取出冻存的小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动，使其在12分钟内完全融化。将融化的细胞悬液转移至离心管中，加入适量的完全培养基，轻轻吹打均匀。1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用适量的完全培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。3.细胞传代当细胞生长至对数生长期时，进行传代培养。弃去细胞培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞23次。加入适量的胰蛋白酶消化液，使胰蛋白酶覆盖细胞表面，置于37℃培养箱中消化12分钟，观察细胞形态，当细胞变圆、彼此分离时，立即加入完全培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使其分散成单细胞悬液。按照一定比例将细胞悬液接种于新的细胞培养瓶中，加入适量的完全培养基，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。

细胞融合1.脾细胞的制备选取免疫后的小鼠，颈椎脱臼处死，浸泡在75%乙醇中消毒5分钟。在超净工作台中，取出小鼠脾脏，置于盛有PBS缓冲液的培养皿中。用镊子轻轻挤压脾脏，使脾细胞释放到PBS缓冲液中，制成脾细胞悬液。将脾细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用适量的完全培养基重悬脾细胞，计数细胞数量，调整细胞浓度至1×10⁷个/ml。2.细胞融合取对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用适量的完全培养基重悬骨髓瘤细胞，计数细胞数量，调整细胞浓度至1×10⁷个/ml。将脾细胞悬液和骨髓瘤细胞悬液按照1:1的比例混合于离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。轻轻弹击离心管底部，使细胞沉淀松散，然后在37℃水浴中预热5分钟。逐滴加入预热至37℃的50%PEG溶液，边加边轻轻搅拌，持续作用12分钟。缓慢加入预热的完全培养基，终止PEG的作用，边加边轻轻搅拌，持续作用35分钟。1000rpm离心5分钟，弃去上清液。用适量的HAT培养基重悬细胞，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。

单克隆抗体制备1.阳性杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后的第2天，观察细胞生长情况，更换新鲜的HAT培养基。在细胞融合后的第710天，当杂交瘤细胞生长至肉眼可见的克隆时，进行阳性杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。具体步骤如下：将抗原包被于酶标板孔中，4℃过夜。弃去包被液，用PBS缓冲液冲洗酶标板3次，每次3分钟。加入封闭液，37℃封闭1小时。弃去封闭液，用PBS缓冲液冲洗酶标板3次，每次3分钟。加入细胞培养上清，37℃孵育1小时。弃去细胞培养上清，用PBS缓冲液冲洗酶标板3次，每次3分钟。加入羊抗鼠IgGHRP，37℃孵育1小时。弃去羊抗鼠IgGHRP，用PBS缓冲液冲洗酶标板5次，每次3分钟。加入底物溶液，室温避光显色1015分钟。加入终止液，终止显色反应。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值，筛选出吸光度值较高的阳性杂交瘤细胞。2.阳性杂交瘤细胞的克隆化采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化。具体步骤如下：将阳性杂交瘤细胞计数，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度至50个/ml。在96孔细胞培养板中，每孔加入100μl细胞悬液，然后在每孔中加入100μl含20%小牛血清的RPMI1640培养基，使每孔细胞浓度约为25个/ml。将96孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，每天观察细胞生长情况，待细胞克隆生长至肉眼可见时，进行阳性克隆的筛选。重复有限稀释法23次，直至获得稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。3.单克隆抗体的大量制备将筛选出的单克隆杂交瘤细胞株接种于Balb/c小鼠体内，进行腹水制备。具体步骤如下：选取68周龄的Balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂，致敏小鼠。710天后，腹腔注射1×10⁶个单克隆杂交瘤细胞。观察小鼠腹水生长情况，当腹水明显增多时，用无菌注射器抽取腹水，离心1000rpm5分钟，收集上清液，即为单克隆抗体。将腹水用饱和硫酸铵沉淀法进行纯化，具体步骤如下：取腹水，缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，4℃过夜。10000rpm离心30分钟，弃去上清液。用适量的PBS缓冲液溶解沉淀，然后装入透析袋中，在PBS缓冲液中透析过夜，去除硫酸铵。透析后的溶液即为纯化后的单克隆抗体，分装保存于20℃备用。

四、实验结果与分析

细胞培养结果通过倒置显微镜观察，细胞复苏后生长良好，形态正常，呈圆形或椭圆形，贴壁生长。细胞传代后，生长速度较快，细胞密度逐渐增加。在细胞培养过程中，定期更换培养基，细胞生长状态稳定，未出现污染现象。

细胞融合结果细胞融合后，在96孔细胞培养板中可见细胞克隆生长。通过间接ELISA法筛选，获得了多株阳性杂交瘤细胞。对阳性杂交瘤细胞进行克隆化后，获得了稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。

单克隆抗体制备结果将单克隆杂交瘤细胞株接种于Balb/c小鼠体内，成功制备了腹水。对腹水进行纯化后，获得了高纯度的单克隆抗体。通过ELISA检测，单克隆抗体具有较高的特异性和亲和力，能够与抗原特异性结合。

五、讨论与结论1.讨论在细胞培养过程中，要注意无菌操作，避免细胞污染。定期更换培养基，保持细胞生长环境的稳定。细胞融合是细胞工程中的关键技术之一，PEG的浓度和作用时间对细胞融合效率有重要影响。在实验中，要根据细胞类型和实验要求，优化PEG的使用条件。单克隆抗体制备过程中，阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化是关键步骤。采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，具有灵敏度高、特异性强等优点。有限稀释法是常用的克隆化方法，通过多次克隆化，可以获得稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。2.结论通过本次自选实验，成功掌握了细胞培养、细胞融合、单克隆抗体制备等细胞工程技术。获得了稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株，并制备了高纯度的单克隆抗体。实验结果表明，细胞工程技术在生物医学领域具有重要的应用价值，可以为疾病诊断、治疗和药物研发提供有力的工具。

六、注意事项1.实验操作过程中要严格遵守无菌操