微生物细胞计数及染色操作

微生物细胞计数及染色操作

河南师范大学环境科学与工程实验教学中心一、目的要求学会血球计数板的使用方法了解革兰氏染色的原理学习并掌握革兰氏染色的方法二酵母细胞计数原理

微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。

细菌染色基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gramstain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。肽聚糖(peptidoglycan)革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥青霉素作用点溶菌酶作用点N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链肽聚糖(peptidoglycan)革兰阳性菌细胞壁特殊组分壁磷壁酸膜磷壁酸革兰阴性菌细胞壁特殊组分革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较细胞壁革兰阳性菌革兰阴性菌强度较坚韧较疏松厚度20-80nm10-15nm肽聚糖层数可多达50层1-2层肽聚糖含量占细胞壁干重50%-80%占细胞壁干重5%-20%磷壁酸+—外膜—+脂蛋白—+脂多糖—+革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basicdye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorisingagent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液——结晶紫（crystalviolet）媒染剂——碘（iodine）脱色剂——95％的酒精（ethanol）复染液——番红三、实验器材大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌；草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数板、载玻片等。麦芽汁培养基、酵母菌。吸管、吸水纸等。四、实验步骤1．涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（一）染色实验2．染色（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。（4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。大肠杆菌革兰氏染色炭疽芽胞杆菌(二)酵母细胞数的测定操作方法1.血球计数板的构造

血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格的长和宽各为1m，深度为，其体积为0.1mm3。

计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成，见图。2.血球计数板的使用(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即可。

(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。(5)计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。

4.血球计数板的清洁血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。

1．结果列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌的染色反应，并判断它们分别是G-或G+.2．思考题（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？五、实验报告9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。4月-254月-25Wednesday,April2,202510、人的志向通常和他们的能力成正比例。19:59:4019:59:4019:594/2/20257:59:40PM11、夫学须志也，才须学也，非学无以广才，非志无以成学。4月-2519:59:4019:59Apr-2502-Apr-2512、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。19:59:4019:59:4019:59Wednesday,April2,202513、志不立，天下无可成之事。4月-254月-2519:59:4019:59:40April2,202514、ThankyouverymuchfortakingmewithyouonthatsplendidoutingtoLondon.ItwasthefirsttimethatIhadseentheToweroranyoftheotherfamoussights.IfI'dgonealone,Icouldn'thaveseennearlyasmuch,becauseIwouldn'thaveknownmywayabout.。02四月20257:59:40下午19:59:404月-2515、会当凌绝顶，一览众山小。四月257:59下午4月-2519:59April2,202