血液检验 17.血栓与止血检验的基本方法 下 学习资料

血栓与止血检验的基本方法（下）梁少聪南方医科大学第二临床医学院血液学检验教研室12025/4/2止血与血栓检验【目的与要求】

1.掌握血栓与止血检验的基本方法的性质、原理、结果判断及分析。2.熟悉各试验方法、临床意义。【教学内容】

1.血栓与止血的筛查试验：一期/初期止血的筛查试验，二期止血的筛查试验，纤溶活性的筛查试验。2.血栓与止血的确诊试验：血管内皮细胞的检验、血小板的检验、凝血因子的检验、抗凝物质的检验、纤溶活性的检验。22025/4/2止血与血栓检验第十一章基本方法第一节血栓与止血的筛查试验（P326）第二节血管内皮细胞的检验第三节血小板的检验第四节凝血因子的检验第五节抗凝物质的检验第六节纤溶活性的检验第七节血液流变学的检验32025/4/2止血与血栓检验筛查试验4筛查试验血管血小板凝血系统抗凝系统纤溶系统初期二期纤溶2025/4/2止血与血栓检验二期止血筛查试验（一）凝血酶原时间（PT）（二）活化部分凝血活酶时间（APTT）（三）凝血时间（CT）（四）凝血酶时间（TT）（五）蛋白C活性依赖凝固时间（六）活化蛋白C抵抗试验52025/4/2止血与血栓检验（五）蛋白C活性依赖凝固时间6激活剂APTT+APC2025/4/2止血与血栓检验NR（正常化比值）=(PCAT:PCAT/0)待测血浆xCF正常：APTT延长存在APC-R：不延长/延长不明显临床意义：PC、PS缺陷时，PC系统不能活化，PCAT缩短，NR减低。存在APC-R（抵抗APC灭活凝血因子）时，PCAT缩短，NR减低。内源凝血系统？72025/4/2止血与血栓检验（六）活化蛋白C抵抗试验8APTT+APC2025/4/2止血与血栓检验正常：APTT延长存在APC-R：不延长/延长不明显临床意义：存在APC抗体存在APC某种抑制物蛋白S缺乏基因突变导致FVa和FVIIIa不被灭活其他92025/4/2止血与血栓检验FactorVLeiden102025/4/2止血与血栓检验纤溶活性的筛查试验一、血浆纤维蛋白（原）降解产物FDPs二、血浆D-二聚体三、血浆鱼精蛋白副凝固试验（3P）四、血浆优球蛋白溶解时间112025/4/2止血与血栓检验PL激肽释放酶12-PK链激酶、尿激酶内激活外激活外源性激活纤溶活性的检验122025/4/2止血与血栓检验13IIa纤维蛋白溶解系统

2025/4/2止血与血栓检验一、FDPs的检测Fibrinogendegradationproducts检测方法：利用FDPs的抗原性胶乳凝集法免疫比浊法ELISA142025/4/2止血与血栓检验临床意义：显著升高：DIC，DVT，APL，原发性纤溶亢进，溶栓治疗。轻度升高：肝肾疾病，外伤，术后，某些恶性肿瘤、急性感染。FDPs的检测152025/4/2止血与血栓检验二、D-dimer的检测检测原理：检测方法的建立有赖于不同的抗D-Dimer的单克隆抗体抗原抗体反应检测方法：胶乳凝集法（定性或半定量）免疫比浊法（仪器法）ELISA胶体金免疫渗透试验162025/4/2止血与血栓检验172025/4/2止血与血栓检验D-dimer的检测临床应用：升高：血栓前状态与血栓性疾病，eg.DVT、DIC、肺栓塞、心梗、脑梗等，妊娠期原发性与继发性纤溶鉴别：阴性基本可排除血栓形成治疗监测：溶栓治疗有效时，D-dimer先增高，后逐渐下降；含量持续升高或下降缓慢，提示药物用量不足。

DIC抗凝治疗中，高水平的D-dimer持续下降，间接说明凝血过程在减缓或中止，治疗有效；而持续升高说明治疗无效。182025/4/2止血与血栓检验D-dimer与FDPs组合分析FDPs（－）D-D（－）FDPs（－）D-D（＋）FDPs（＋）D-D（－）FDPs（＋）D-D（＋）纤溶活性正常原发性纤溶DIC,溶栓治疗FDPs假阴性、DD假阳性？192025/4/2止血与血栓检验三、血浆鱼精蛋白副凝固试验（3P）原理：继发性纤溶时，形成可溶性FM-FDP复合物。鱼精蛋白可使FM-FDP解离，FM-FM自行聚合沉淀，出现副凝固。plasmaprotamineparacoagulationtest.临床意义：阳性：DIC早、中期阴性：DIC晚期，原发性纤溶亢进原发性与继发性纤溶鉴别手工操作，现已少用。202025/4/2止血与血栓检验原理：血浆优球蛋白组分含有Fg、PLG、PL和纤溶酶原活化剂。将优球蛋白溶于缓冲液中，加入适量钙或凝血酶溶液，Fg转成纤维蛋白，37℃观察凝块完全溶解所需时间临床评价：↓见于原纤和继纤亢进 ↑纤溶活性降低目前少用四、优球蛋白溶解时间的检测ELT212025/4/2止血与血栓检验第五节抗凝物质的检验222025/4/2止血与血栓检验第五节抗凝物质的检验一、生理性抗凝蛋白生理性抗凝蛋白血浆蛋白C血浆蛋白S血浆组织因子途径抑制物二、病理性抗凝物质血浆肝素及类肝素物质血浆狼疮抗凝物血浆凝血因子抑制物232025/4/2止血与血栓检验一、生理性抗凝蛋白243TFPI2025/4/2止血与血栓检验Interactionswithheparin252025/4/2止血与血栓检验抗凝血酶检测Antithrombinactivity,AT:A发色底物法Antithrombinantigen,AT:Ag免疫火箭电泳ELISA2025/4/2止血与血栓检验26止血与血栓检验抗凝血酶活性AT:AAT活性检测原理：待测血浆中的AT抑制已知过量的Thrombin或FXa，剩余的酶用发色底物法检测。目前常用FXa。272025/4/2临床意义AT升高：口服抗凝药，急性出血期等AT降低：遗传性AT缺乏:遗传性AT缺陷，

易栓症（thrombophilia)TypeⅠ,TypeⅡ，杂合子在40%-60%282025/4/2止血与血栓检验临床意义获得性AT缺乏：合成减少（肝病，早产儿）丢失过多（肾病综合征）消耗增加（DIC）药物诱导（L-门冬酰胺酶）

292025/4/2止血与血栓检验二、血浆蛋白C（PC）的检测PC:activity,PC:A凝固法（APTT）发色底物法PC:antigen,PC:Ag免疫火箭电泳302025/4/2止血与血栓检验血浆蛋白C（PC）活性检测凝固法-APTT312025/4/2止血与血栓检验发色底物法322025/4/2止血与血栓检验PC活性检测方法评价凝固法影响因素多，如存在狼疮抗凝物质、FⅧ活性升高、FⅤ变异等。若存在APC抵抗时，血浆凝固时间假性缩短。可用乏PC的基质血浆进行稀释以纠正。确诊遗传性PC缺乏，活性测定应选发色底物法。332025/4/2止血与血栓检验血浆蛋白C（PC）抗原检测ELISA342025/4/2止血与血栓检验临床意义（PC）遗传性PC缺陷纯合子0-20%杂合子<50%其他疾病（肝病、VitK缺乏）口服抗凝要的影响口服香豆素类抗凝药初期，由于PC比其他依赖VitK的凝血因子半衰期短，首先迅速减低，容易导致短暂、严重血液高凝状态。可发生血栓栓塞或香豆素诱导的皮肤坏死352025/4/2止血与血栓检验遗传性蛋白C（PC）缺陷362025/4/2止血与血栓检验（三）、血浆蛋白S（PS）检测372025/4/2止血与血栓检验血浆蛋白S（PS）检测382025/4/2止血与血栓检验检测原理：freePS:activity,FPS:A凝固法：PTfreePS:antigen,FPS:Ag

胶乳凝集比浊法免疫火箭电泳血浆蛋白S（PS）检测392025/4/2止血与血栓检验凝固法游离蛋白S活性FPS:A402025/4/2止血与血栓检验＋PSPSPSPSPSPSPSPSPS＋PSPSPSPSPSPSPSPS游离蛋白S抗原胶乳凝集比浊法C4bBP412025/4/2止血与血栓检验包被抗人PS的mAb两种胶乳颗粒发生凝集游离蛋白S抗原ELISA422025/4/2止血与血栓检验临床意义遗传性PS缺陷TypeⅠ——insufficientquantityTypeII

——abnormalfunctionTypeIII——increasedclearanceoffreePS432025/4/2止血与血栓检验临床意义获得性PS缺陷肝脏疾病、VitK缺乏症妊娠及新生儿的PS降低口服抗凝药，PS降低442025/4/2止血与血栓检验（四）、组织因子途径抑制物（TFPI）检测TFPI:A发色底物法（Xa、TF/FⅦa）TFPI:AgELISA（双抗体夹心）外源凝血途径抑制剂，缺陷导致高凝状态。多为获得性缺乏，DIC、脓毒血症、大手术等。增加可见于血管内皮损伤性疾病，败血症、肾衰等。452025/4/2止血与血栓检验病理性抗凝物质肝素、类肝素狼疮抗凝物LAC凝血因子抑制物462025/4/2止血与血栓检验一、血浆肝素及类肝素样物质检测检测原理：1.甲苯胺蓝纠正试验——TT+甲苯胺蓝2.血浆肝素定量——发色底物法，ⅩaUFH：inhibitionofthrombinandfactorXaLMWH：inhibitionoffactorXa472025/4/2止血与血栓检验482025/4/2止血与血栓检验肝素抗凝血酶的作用：肝素与ATⅢ的结合，肝素与凝血酶的直接结合肝素增强抗凝血酶-Ⅲ抑制FXa的作用：不需要肝素与FXa直接接触临床意义肝素增多：抗凝治疗、体外循环、血液透析等。类肝素样物质增多：严重肝病、SLE、流行性出血热、某些肿瘤。肝脏损伤：肝素在肝脏的降解作用减弱，患者可有较明显出血症状。492025/4/2止血与血栓检验狼疮抗凝物Russell蛇毒时间（RVVT）凝血因子缺陷：用正常血浆可纠正存在LAC：用高浓度磷脂可纠正502025/4/2止血与血栓检验XVII纤维蛋白原纤维蛋白PL、Ca2+蛇毒试剂临床意义LAC是一组抗磷脂或磷脂与蛋白（β2-GPI和凝血因子）复合物的抗体，可以干扰磷脂依赖的止血反应和体外凝血试验（APTT/SCT/RVVT等）。血浆LAC阳性，可见于自身免疫性疾病（SLE）、病毒感染、复发性流产等。体外试验产生抗凝效应，体内促进血栓形成2025/4/2止血与血栓检验51凝血因子抑制物纠正试验混合血浆法2025/4/2止血与血栓检验52常见8因子抑制物时间依赖性2025/4/2止血与血栓检验53筛查试验确诊试验第六节纤溶活性的检验542025/4/2止血与血栓检验五、血浆纤溶酶原（PLG）的检测检测原理：PLG:A发色底物法PLG:AgELISA552025/4/2止血与血栓检验临床意义降低：合成减少：肝实质损伤消耗增多：DIC、溶栓治疗、原发性纤溶亢进等异常PLG血症：活性降低，含量一般正常遗传性PLG缺乏：极少见升高：某些恶性肿瘤、糖尿病方法评价：发色底物法简便、快速；影响因素较多，欠灵敏。562025/4/2止血与血栓检验血浆组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）检测检测原理：t-PA:A发色底物法t-PA:AgELISA572025/4/2止血与血栓检验血浆纤溶酶原活化抑制剂（PAI）检测检测原理：PAI:A发色底物法PAI:CSDS利用t-PA-PAI形成1:1无活性复合物582025/4/2止血与血栓检验t-PA/PAI-1系统临床意义：PAI减少，可增高出现风险PAI增多，可导致血栓风险术前血浆PAI-1水平与术后DVT发生有显著相关性。592025/4/2止血与血栓检验第七节血液流变学检验2025/4/2止血与血栓检验60全血粘度检测毛细管粘度计检测法旋转式粘度计检测法临床评价：增高：冠心病、心肌梗死、高血压病、脑血栓形成、深静脉血栓形成、糖尿病、高脂血症、恶性肿瘤、肺心病、真红、MM、烧伤等。减低：见于各种类型贫血2025/4/2止血与血栓检验61血浆粘度检测原理：毛细管粘度计检测法：根据一定体积的受检血浆流经一定半径和一定长度的毛细管所需的时间与该管两端压力差计算出粘度值。参考值：（1.64±0.05）mPa•s临床评价：升高：所有引起血浆蛋白质异常增高的疾病均可导致血浆粘度升高，如MM、原发性巨球蛋白血症、纤维蛋白原增高症、糖尿病、高脂血症、某些胶原性疾病等。2025/4/2止血与血栓检验62红细胞变形性检测原理：微孔过滤法：用缓冲液将受检血配制成一定容积的10％红细胞悬液，测定通过5μm直径微孔膜所需的时间，与对比液通过的时间比较，计算出红细胞的滤过指数，即红细胞的变形性。滤过指数越高，变形性越差。参考值：0.29±0.10临床意义：增高：见于红细胞变形性减低的疾病，如遗传性球形红细胞增多症、珠蛋白生成障碍性贫血、心肌梗死、脑血栓形成、高血压、冠心病、高血脂、糖尿病等。2025/4/2止血与血栓检验63止凝血试验的自动化2025/4/2止血与血栓检验64全自动凝血分析仪2025/4/2止血与血栓检验651.生物学方法2.生物化学方法3.免疫方法止凝血试验的自动化生物学方法血浆中凝血因子激活，纤维蛋白原变为纤维蛋白，发生物理特性变化透射比浊法散射比浊法光学法：血浆透明度的改变电流法：纤维蛋白的导电性粘度法：纤维蛋白的产生，血浆粘度增加磁珠法仪器设计基础仪器设计原理662025/4/2止血与血栓检验举例：粘度法PT、APTT672025/4/2止血与血栓检验生物化学方法激活的凝血因子皆为酶，可激活特异的分解底物而显色

对酶的检测：即在含酶的样品中直接加入发色底物。对酶原的检测：必须先用激活剂将酶原激活使其位点暴露,再加入基质,使酶将发色物质上的显色物质(PNA)裂解下来对酶抑制物检测：首先往加入待测样品加入过量对应酶，中和该抑制物剩余的酶可裂解基质产生

PNA仪器设计原理仪器设计基础止凝血试验的自动化682025/4/2止血与血栓检验发色底物首先人工合成可以被待测凝血活酶催化裂解的化合物，且化合物连接上产色物质，在检测过程中产色物质可被解离下来，使被检样品中出现颜色变化，根据颜色变化可推算出被检凝血活酶的活性。产色物质一般选用连接对硝基苯胺（PNA）。游离的PNA呈黄色，其测定波长选用405nm。速率法、终点法2025/4/2止血与血栓检验692025/4/2止血与血栓检验70举例2:

蛋白C检测(PC)举例1:

凝血酶检测

凝血酶（血浆）发色底物

多肽+

PNA

加过量的激活剂蛋白C活化蛋白C

发色底物

多肽+

PNA止凝血试验的自动化712025/4/2止血与血栓检验止凝血试验的自动化举例3:

抗凝血酶检测AntithrombinHeparinThrombin(过剩量)（酶）（血浆）Heparin＋AntithrombinIIIHeparinThrombin(过剩量)Thrombin(残存部分)（失活）AAAAAA（合成基质）AAAAAA比色定量（405nm）+++pNApNAAntithrombin722025/4/2止血与血栓检验免疫学方法利用抗凝（凝血）因子与抗体结合反应，血浆发生浊度变化透射比浊法散射比浊法直接浊度分析乳胶比浊分析仪器设计基础仪器设计原理止凝血试验的自动化732025/4/2止血与血栓检验散色光比浊法透射光比浊法信号

激发光透射光激发光信号

散射法信号可以通过提高激发光的强度人为增强。散射光比浊的灵敏度是透射光比浊法的100倍。举例:

(D-Dimer)乳胶标记抗体+血浆D-Dimer反应止凝血试验的自动化742025/4/2止血与血栓检验小结2025/4/2止血与血栓检验7576筛查试验确证试验一期血管内皮细胞BT、PLT#、CRT、CT(栓塞时间)vWF、ET-1、TM、PGI2代谢物血小板PLT粘附、聚集、糖蛋白（